『 SNU-283 ~ SNU-484 : 1989년 11월 ~ 1990년 8월』, 박재갑 외 45인, 서울대학교(SNU) 세포주 수립에 관한 연구 : 1989년 11월 - 1990년 8월, 대한암학회지, 1991;23:169-187.
Journal of Korean Cancer
Association 23, 2, June, 1991
*본 연구는 1990년도 정부출연금 연구사업 연구비의 보조에 의한 것이며, 위장관 종양세포주의 수립에 관하여는 1990년도 목적기초 연구비의 일부 지원을 받았음.
Thirty-eight human cancer cell lines have been established (success rate 18.4%) from 205 tumor specimens from November 1989 to August 1990 at Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine. We used AR5 media (ACL4 media in RPMI-1640 plus 5% FBS) for routine culture for all tumor cells except gastric cancers. RIO media (RPMI-1640 plus 10% FBS) was used for gastric cancer. Thyroid stimulating hormone (TSH) was added to AR5 for thyroid cancer.
Established cancer cell lines are 1 gastric adenocarcinoma, 3 colorectal adenocarcinoma, 7 hepatocellular carcinoma, 2 breast ductal carcinoma, 7 renal cell carcinoma, 4 transitional cell carcinoma of urinary bladder, 2 glioblastoma multiforme, 1 oligodendroglioma, 1 gallbladder carcinoma, 2 pancreatic adenocarcinoma, 3 Wilms’ tumor, 1 lung cancer, 1 thyroid papillary cancer, 1 ovarian cancer, 1 ampulla of Vater adenocarcinoma and 1 metastatic squamous cell carcinoma of thigh. Another hepatocellular carcinoma line (SNU-182) initiated in June 1989 was established after 16 months.
AR5 media was useful especially for establishment of cell lines from hepatocellular carcinoma (success rate 36.8% [7/19]), pancreatic cancer (success rate 100% [2/2]) glioblastoma multiforme (success rate 100% [2/2]) and urologic cancers such as renal cell carcinoma (success rate 46.7% [7/15]), transitional cell carcinoma of urinary bladder (success rate 33.3% [4/12])and Wilms’ tumor (success rate 75.0% [3/4]).
Key Word: SNU cell lines
암 관련 연구에 있어서 신선한 조직표본을 사용하는 경우, 조직의 양이 적다든지，다시 실험을 하고자 할 때 조직이 부족하여 반복실험이 불가능하거나, 섬
유 세포 및 조직구등 다른 세포들이 함께 있어 순수한 암세포만을 요구하는 실험을 할 수가 없는등 여러가 지 문제점이 있다. 암세포주를 이용한 연구는 세포를 무한정 얻을 수 있고, 같은 실험을 반복할 수 있으며, 세포내의 살아있는 상태의 대사작용을 연구할 수 있고, 체내에서는 불가능한 조작을 할 수 있으며, 연구소간에 세포주를 교환할 수 있어 같은 재료로 연구를 할 수가 있다.
암세포주는 현재 암연구분야에서 활발히 연구되고 있는 분야인 암세포의 분화，암유전자의 발현, 항암제에 대한 감수성，방사선 치료에 대한 감수성, 항암
제에 대한 내성，암세포의 침습 및 전이, 암표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 항암효과, 암세포 성장 및 억제 인자와 세
포유전자 연구 등에 있어서 매우 유용하게 활용되고 있다.
본 저자들은 1982년부터 세포주를 개발하기 위하여 연구를 시작하였다. SNU4 위암세포주를 1984년 4월에 수립할 수 있었고, 누드 마우스의 이용과 더불어 배양 기술의 향상으로 1984년 3월부터 12월 사이에 SNU-C1, SNU-C2A (ATCC 250.1), SNU-C2B (ATCC 250), SNU-C4 및 SNU-C5 등 5종류의 대장암 세포주
를 수립하였다1). 1988년에 11예의 암세포주와 2예의 B-림프아구양 세포주의 수립을 보고하였고 1990년에는 22예의 암세포주와 3예의 B-림프아구양 세포주 등 SNU세포주 수립의 결과를 보고한 바 있다2, 3).
아직 해당 분야의 암 연구를 위하여 현재까지 국내에서 수립된 암세포주로는 절대적으로 미홉하며 각분야에서 여러 종류의 암 세포주를 필요로 하고 있어,
다양한 세포주들을 많이 수립하여 해당 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 계속 노력하고 있다.
본 연구에서는 1989년 11월부터 1990년 8월까지 사이에 206 예의 종양조직 (조직번호 283번부터 488번까지)으로부터 세포주 수립을 시도하여 1990년 11월까지 세포주 수립이 완료된 38(18.4%) 종류의 암세포주와 9종류의 B-림프아구양 세포주 및 1989년 6월에 배양을 시작하여 16개월간의 배양후 세포주로 수립된 1예의 간암세포주에 관하여 문헌고찰과 함께 보고하고자 한다.
세포주 수립에 사용한 재료는 1989년 11월부터 1990년 8월까지 서울대학교병원에 입원한 종양환자들의 수술 중에 채취한 조직이거나 항암제 투여 목적으
로 입원중인 환자들의 흉수, 복수 등에서 얻었다. 고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용 하고 흉수, 복수 등은 원심 침전 시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다. 배양을 시도한 종양의 종류는 위암, 결장암, 갑상선암, 유방암, 간암, 췌장암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 골육종, 폐암, 식도암, 신장암, 방광암, 후두암, 망막아세포종, 월름스 종양 및 신경아세포종 등 서울대학교병원에 입원하는 모든 암종류를 대상으로 하였다.
세포주 배양에 사용한 배지의 제조를 위하여는 RPML1640배지에 ACL-4(61) 배지 제조시에 첨가하는 인자들을 첨가하여 이 배지를 AR이라 부르고 56°C에서 30분간 가열하여 비동화시킨 우태혈청을 5%첨가하여 만든 배지를 AR5라 하였다. AR5배지의 조성은 Table 1과 같다. RPMI 용액에 비동화시킨 우태혈청을 10%첨가하여 만든 배지는 R10배지라 하였다. 위암조직의 배양에는 R10배지를 사용하였다. 갑상선암조직 외 배 양에는 AR5에 thyroid stimulating hormone (TSH)을 10ng/ml 첨가한 AR5T 배지를 사용하여 배양하였으며, 나머지 종양의 배양에는 모두 AR5를 사용하였다.
5%의 탄산가스와 95% 공기가 공급되고 적절한 습기가 유지되는 37°C 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 역위 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다. 종양세포가 잘 자라게 되면 계대배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존시켰다. 부유하여 자라는 세포 들은 그대로 모아 일부를 계대시키고 플라스크 바닥에 부착하여 자라는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기 단계에서 암세포와 함께 섬유아세포 등 간질세포들의 과다한 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별트립신 처리를 하거나 혈청이 함유된 성장인자 첨가 배지인 AR5 배지를 무혈청 배지인 ACL-4 배지로 일시 전환시켜 간질세포를 제거하도록 하였다.
1989년 11월부터 1990년 8월까지 10개월 간에, AR5, AR5T 및 R10 배지를 이용하여 38종류의 종양세포주와 9종류의 림프아구양 세포주를 수립할 수 있
었다 (Table 2, 3).
위암은 31예를 배양시도하여 R10 배지에서 1예(SNU-484; Fig. 39)를 수립할 수 있었다.
대장암은 18예를 배양시도하여 AR5 배지에서 3예(SNU-283; Fig. 2, SNU-479; Fig. 37)를 수립 하였다,
간세포암은 19예를 배양시도하여 AR5 배지에서 7예 (SNU-354; Fig. 15, SNU-368; Fig. 17, SNU-387; Fig. 21,SNU-398; Fig. 23, SNU423; Fig. 27, SNU-
449; Fig. 31, SNU-475; Fig. 35)를 수립 하였다.
유방암은 15예를 시도하여 2예 (SNU-306; Fig. 3,SNU-334; Fig. 11)를 수립하였다.
신장암은 15예를 시도하여 7예 (SNU-326; Fig. 8, SNU-328; Fig. 9, SNU-333; Fig. 10, SNU-349; Fig. 14, SNU-359; Fig. 16, SNU-376; Fig. 20, SNU-482; Fig.
38) 를 수립하였다.
방광암은 12예를 시도하여 4예 (SNU-342; Fig. 12,SNU-343; Fig. 13, SNU-396; Fig. 22, SNU-456; Fig.32)를 수립하였다.
뇌종양 중에는 다형성교아종을 2예 시도하여 2예 (SNU-444; Fig. 30, SNU-466; Fig. 34, SNU-466; Fig.34)를 수립하였으며 회돌기교종울 3예 시도하여 1예
(SNU-399 Fig. 24)를 수립 하였다.
월름스종양은 4예 시도하여 3예(SNU-426; Fig. 28, SNU-442; Fig. 29, SNU-458; Fig. 33)를 수립하였다.
폐암은 4예를 시도하여 1예 (SNU-371; Fig. 18)를 수립하였다.
갑상선 암은 AR5T 배지를 이용하여 5예중 1예 (SNU-373; Fig. 19)를 수립 하였다.
췌장암은 2예를 시 도하여 2예 (SNU-324; Fig. 7, SNU-410; Fig. 26)를 수립 하였다.
난소암은 4예중 1예 (SNU-323; Fig. 6)를 수립하였다.
담낭암은 2예를 시도하여 1예 (SNU.308; Fig. 4)를 수립하였다.
파터팽대부암은 1예를 시도하여 세포주(SNU-478; Fig. 36)가 되었으며 대퇴부의 전이성 편평상피암 1예도 배양하여 세포주 (SNU.316; Fig, 5)가 되었다. 그
이외에 배양을 시도하였으나 세포주가 수립되지 않았던 종양으로는 육종이 8예, 백혈병이 18예，림프종이 9예, 대장용종이 4예 그리고 기타 24예 등이었다
(Table 2). 간세포암 1예는 1989년 6월부터 16개월간의 배양후 세포주 (SNU-182, Fig. 1)로 수립되었다.
고 안
저자들은 여러 종류의 암세포주 수립을 위한 ACL4의 유용성을 알아보기 위하여 1987년도에 규정배지인 ACL-4를 사용하면서 대조 배지로는 동시에 R10 배지를 사용하였다. 그 결과 무혈청 규정배지인 ACL4에서는 섬유아세포의 성장이 효과적으로 억제되는 것을 알았고 ACL-4 배지에서 자궁암 세포주 (SNUH-17) 및 후두암 세포주(SNUH-46) 를 수립할수 있었다2). 그리고 ACL-4 배지에서 위암 환자와 급성골수성 백혈병 환자로부터 2종류의 비종양성 B 림프아구양 세포주 (SUNH-9 및 SNUH-20)를 수립할수 있었다. 자궁암 세포의 성장을 위해서는 ACL-4 배지 속의 sodium pyruvate가 필수적 이라는 것도 알게 되었다2,3). ACL-4 배지에서는 섬유아세포의 과중식이 억제되어 후두암 세포주 SNUH-46이 수립되었지만 일단 수립된 후에는 혈청 첨가 배지인 R10에서 더 빨리 자라는 것을 알 수 있었다.
1988년 하반기부터는 ACL-4 배지에 우태혈청을 5% 첨가한 AR5 배지를 이용하여 일단온 모든 세포의 성장을 유도하고 그 후 섬유아세포의 과증식이 관찰되어 암세포의 성장이 억제될 때에는 감별 트림신 처리를 하거나 무혈청 배지인 ACL-4로 일시 바꾸어 배양하여 섬유아세포를 제거하도록 노력하여 직장암 세포주인 SWJ-61 과 대장암 세포주인 SNU-67을 수립하였다.
1988년 후반부터 1989년까지는 기본배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 배지가 좀더 이상적일 것이 라는 가정하에 R10 대신에 DF10과 AR5 대신에 ADF5배지를 사용하고 여성암의 배양에는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하여 갑상선암 세포주(SNU-80), 대장암 세포주 (SNU-81, SNU-175), 직장암 세포주 (SNU- 254), 난소암세포주 (SNU-119, SNU-445, SNU-251), 망막아세포종 세포주(SNU-125, SNU-426),자궁 근육종 세포주(SNU-135), 위 근육종 세포주 (SNU-141), 폐암 세포주 (SNU-160), 자궁 내막암 세포주(SNU-184), 뇌의 다형성교아종 세포주(SNU-201), 흑색종 세포주(SNU-207), 및 신장암 세포주(SNU-228, SNU-267)등 20종의 암세포주와 3종류의 B-림프아구양 세포주를 수립하여 보고한 바 있다3). 그 당시 보고한 후두암 세포주 (SNU-266)와 직장암세포주(SNU-280)는 계대 배양이 오래 진행되지 않아 세포주로 부를 수가 없게 되었다.
이번 연구에서의 암세포주의 성공율을 보면, AR-5배지가 간세포암(36.8%), 췌장암(100%), 신세포암(46.7%), 방광암(이행세포암)(33.3%) 및 월름스 종양(75%)외 수립에 특히 유용함을 알 수 있었다(Table 2).
위암세포주는 다른 장기의 암세포주보다 수립이 어려워 수립보고된 세포주의 수가 많지 않으며 대부분 일본에서 수립되었다4~12). Hojo5)는 1977년 MKN-L, 7, 28, 45, 74를 보고하였고, Sekiguchi 등9)은 1978년 흉수에서 KATO II，III를 수립보고하였다. 저자들도 이번 수립된 것을 포함하여 그간 SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484 등 모두 5개의 위암 세포주를 수립하였다. 1982년부터 1984년까지의 위암 세포주 수립 성공율 3.3%(1/30)에 비하여 아직 성공
율의 향상은 없어, 배양조건 개선 등에 대한 계속적인 연구가 필요하다. 결장암세포주는 문헌상 이미 80종류 이상이 보고되어 있다1, 13~23). 흑색종같은 종양은 배양하기 쉬운 반면, 갈색종이나 췌장의 소도(islet) 세포암은 배양이 아주 어렵다. 결장암의 경우는 그 중간에 해당되며, 부양층13), 영양소를 첨가한 혈청 함유 배지15), 콜라겐젤16) 사용 등 여러가지 배양기술이 응용되어 왔다. Rutzky와 Moyer17)는 결장암세포 배양의 성공울 위해서는, 종양을 처리할 때 효소를 사용하지 말고 가능한 적게 분해하고, 많은 수의 세포를 많이 이식하며, 섬유아세포는 일단 암세포가 자란 후 제거하고, 계대배양은 암세포가 증식되어 세포농도가 높아진후에 하는것이 좋다고 하였다. SNU세포주로는 SNU-C1, SNU-C2A, SNU-C2B，SNU-C4, SNU-61, SNU-67, SNU-70, SNU-81, SNU-254, SNU-283, SNU-407, SNU-479 등 14종류의 대장암 세포주가 수립되어, 이를 패널로 이용한 실험들이 이루어 질 수 있게 되었다.
역학적연구에서 간암과 B형 간염바이러스(HBV) 감염과는 밀접한 관계가 있음이 시사되었으며24, 25), 최근 분자생물학의 발전으로 B형간염 감염 환자에서
수립 된 PLC/PRF/5 나 HCC-M에서 HBV DNA 서열이 발견되어 HBV DNA가 간세포 DNA에 integrate 되는 것이 암세포화와 관계있으리라 여겨지고 있다26~28). PLC/PRF/5, DELSH-5, Hep 3B는 HBV DNA를 integrated form으로 가지며 HBsAg을배지에 분비 하고, FOCUS와 HCC-M은 HBV DNA를 integrated form으로 갖고있으나 HBsAg을 분비 하지는 않는 것으보 보고되어 있다29-33). 그러나 HBV감염의 증거가 없는 간경화 또는 만성간염환사에서도 간암이 발생하는데34) 이들 환자에서는 nonA-nonB 간염바이러스가 관계하리라 추정되고 있다. 따라서 HBV감염뿐만 아니라 NANB감염상태의 간세포암세포주에 대한 연구는 간염바이러스의 발암모델 및 NANB 간염바이러스의 연구에도 중요하다. 현재 수립된 SNU 간세포암세포주는 모두 8종류이며, 이들 간세포암 세포주 패널을 이용하여 성장인자에 대한 연구결과 insulin과 transferrin이 첨가된 배지가 간세포암 세포주의 수립에도 도움이 된다는 것을 알게 되었다35). 앞으로 이들 세포주들은 간암 발생과정의 분자생물학적 연구에 널리 활용될 것이다.
췌장선암세포주는 1963년 Dobrynin이 보고한4)이래 Lieber36),Owens37), Grant38), 등이 보고하였으며, 이들 췌관기원의 췌장선암세포주는 췌장효소 즉 아밀
레이스, 트립신, 카이모트립신 등을 분비하지 않으며39), 일부는 암태아성항원을 분비하는 세포주도 있다. 이번 수립된 SNU-324는 원발부위에서 SNU-410은 간전이 부위에서 수립된 세포주로 모두 체관선암에서 기원한 것이다.
담낭암 세포주는 특성분석과 함께 수립이 보고된것이 4개 정도 밖에 되지 않는다41-44). 이 중Johzaki41)가 보고한 FU-GBC-1은 분화도가 좋고 나머지는 모두 분화도가 나쁘다. FU-GBC-1은 암성복수에서 수립된 담낭선암 세포주로 CA19-9, 암태아성항원, 상피막항원(EMA)등의 상피종양항원을 발현한다. 이번 수립된 SNU-308은 중등도 분화도의 담낭선암에서 수립된 것으로 문헌상 보고된 세포주가 적은 것을 고려하면 귀중한 세포주라 사료된다.
유방암세포주는 1958년 Lafargues등의 보고이래, 일부 고형 침윤성 유관암에서 수립된 유방암 세포주의 보고도 있으나46-48), 대부분은 악성 늑막 삼출
액 45,49-53)에서 수립되었다. 악성 삼출액을 이용한 경우 암세포의 생존도가 높고(70%), 섬유아세포의 오염이 상대적으로 적은 잇점이 있다50). 이번 수립된 유
방암세포주 SNU-306, SNU-334는 원발부위에서 수립되었다. 이들 유방암세포주들은 여성호르몬의 영향등에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
신 세 포 암세포주는 1962년 Ishihara 등55) 이 처음으로 수립을 보고한 이래로 Giard 등56)이 9.5% (2/21) 의 세포주 수립 성공율을 보고하는 등 간헐적인 보고가 있다. Ebert 등57)은 1972~1987년까지 16년 동안 498예의 신세포암을 시도하여 63예(12.7%)의 세포주를 수립하였다고 보고하였다. 이중 46예는 원발부위에서 17예는 전이부위(폐，뇌, 뼈, 림프절)에서 수립되었으며, 세포주 수립 성공율은 원발부위와 전이부위 사이에 차이가 없었다고 하였다. 그러나 수립된 신세포암 세포주는 모두 임상적으로 아주 진행이 나쁜 종양에서 유래되었다고 하였다. 저자들의 경우는 AR5배지를 이용하여 15예를 원발부위에서 시도하여 7예
(46.7%)의 세포주 수립에 성공하여 높은 성공율을 보여 주고 있다, 문헌에 보고된 신세포암 세포주 중에는 에리트로포이에틴 을 지속적으로 분비하는 세포주 58)도있어, 에리트로포이에틴의 생성 및 분비과정에 대한연구에 이용될 수도 있다.
방광의 이행세포암 세포주는 30개 이상이 보고되어 있다59, 60). 저자들은 12예에서 시도하여 4예(33.3%) 성공하였으며, 이번 보고에서 보면 신세포암, 방광
암, 월름스 종양 등 특히 비뇨기계 종양의 수립 성공율이 높았다.
서울대학교 세포주 은행에서 보유하고 있는 74종류의 종양세포주들과 17종류의 림프아구양 세포주들(Table 4)은 추후 특성분석이 이루어진 후에 종양학
관련 연구분야에 광범위 하게 사용될 수 있을 것이다.
결 론
1989년 11월부터 1990년 8월사이에 서울대학교 의과대학 암연구소 종양세포학 연구실에서 206예의 종양조직으로부터 38예 (18.4%)의 종양세포주를 수립
하였다.
AR5배지를 사용한 경우 암세포주의 성공율을 보면 간세포암이 36.8%, 췌장암이 100%, 다형성 교아종이100%, 신세포암이 46.7%, 방광암(이행세포암)이
33.3%, 그리고 월름스 종양이 75%로서 AR5배지는 이들 종양세포주의 수립에 유용함을 알 수 있었다.
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서울대학교 (SNU) 세포주 수립에 관한 연구 :
1989년 11월〜1990년 8월
서울대학교 의과대학 암연구소 종양세포학 연구실, 암연구센터, SNU세포주은행 및 외과1
내과2, 소아과3, 산부인과4 정형외과5, 신경외과6, 흉부외과7
비뇨기과8, 이비인후과9, 안과10 임상병리과11, 병리과12
박재갑1 · 전유미1 · 박규주1 · 양한광1 · 노동영1 · 김선회1
오승근1 · 이건욱1 · 박용현1 · 최국진1 · 김진복1 · 김수태1
허대석2 · 방영주2 · 박선양2 · 김병국2 · 김노경2 · 최규완2
김정룡2 · 고창순2 · 안효섭3 · 최영민4 · 강순범4 · 신희철4
이효표4 · 김승욱4 · 이상훈5 · 이한구5 · 왕규창6 · 정희원6
김현집6 · 한대희6 · 성숙환7 · 김주현7 · 이은식8 · 이상은8
최 황8 · 이종욱8 · 김시황8 · 김영균8 · 김광현9 · 민양기9
유영석10 · 박명희11 · 박성회12 · 김용일12
= Abstract =비뇨기과8, 이비인후과9, 안과10 임상병리과11, 병리과12
박재갑1 · 전유미1 · 박규주1 · 양한광1 · 노동영1 · 김선회1
오승근1 · 이건욱1 · 박용현1 · 최국진1 · 김진복1 · 김수태1
허대석2 · 방영주2 · 박선양2 · 김병국2 · 김노경2 · 최규완2
김정룡2 · 고창순2 · 안효섭3 · 최영민4 · 강순범4 · 신희철4
이효표4 · 김승욱4 · 이상훈5 · 이한구5 · 왕규창6 · 정희원6
김현집6 · 한대희6 · 성숙환7 · 김주현7 · 이은식8 · 이상은8
최 황8 · 이종욱8 · 김시황8 · 김영균8 · 김광현9 · 민양기9
유영석10 · 박명희11 · 박성회12 · 김용일12
Establishment of SNU Cell Lines: November 1989-August 1990
Jae-Gahb Park1, M.D., You-Me Jeon1, M.D., Kyu-Ju Park1, M.D., Han-Kwang Yang1, M.D.
Dong-Young Noh1, M.D., Sun-Whe Kim1, M.D., Seung-Keun Oh1, M.D., Kuhn-Uk Lee1, M.D.
Yong-Hyun Park1, M.D., Kuk-Jin Choe1, M.D., Jin-Pok Kim1, M.D., Soo-Tae Kim2, M.D.
Dae-Seog Heo2, M.D., Yung-Jue Bang2, M.D., Seon-Yang Park2, M.D., Byoung-Kook Kim2, M.D.
Noe-Kyeong Kim2, M.D., Kyoo Wan Choi2, M.D., Chung-Yong Kim2, M.D., Chang-Soon Koh2, M.D.
Hyo-Seop Ahn3, M.D., Young-Min Choi4, M.D., Soon-Beom Kang4, M.D., Hee-Chul Syn4, M.D.
Hyo-Pyo Lee4, M.D., Syng-Wook Kim4, M.D., Sang-Hoon Lee5, M.D., Han-Koo Lee5, M.D.
Kyu-Chang Wang6, M.D., Hee-Won Jung6, M.D., Hyun-Jip Kim6, M.D., Dae-Hee Han6, M.D.
Sook-Whan Sung7, M.D., Joo-Hyun Kim7, M.D., Eun-Sik Lee8, M.D., Sang-Eun Lee8, M.D.
Hwang Choi8, M.D., Chong-Wook Lee8, M.D., Si-Whang Kim8, M.D., Young-Kyoon Kim8, M.D.
Kwang-Hyun Kim9, M.D., Yang Gi Min9, M.D. Young Suk Yu10, M.D., Myoung-Hee Park11, M.D.
Seong-Hoe Park12, M.D. and Yong-II Kim12, M.D.
SNU Cell Line Bank, Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute. Cancer Research Center,
and Department of Surgery1, Internal Medicine2, Pediatrics3. Ob & Gyn4, Orthopedic Surgery5,
Neurosurgery6, Thoracic Surgery7, Urology8, Otolaryngology9, Ophthalmology10,
Clinical Pathology11, and Pathology12
and Department of Surgery1, Internal Medicine2, Pediatrics3. Ob & Gyn4, Orthopedic Surgery5,
Neurosurgery6, Thoracic Surgery7, Urology8, Otolaryngology9, Ophthalmology10,
Clinical Pathology11, and Pathology12
Seoul National University College of Medicine, Seoul, 110-744, Korea
Thirty-eight human cancer cell lines have been established (success rate 18.4%) from 205 tumor specimens from November 1989 to August 1990 at Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine. We used AR5 media (ACL4 media in RPMI-1640 plus 5% FBS) for routine culture for all tumor cells except gastric cancers. RIO media (RPMI-1640 plus 10% FBS) was used for gastric cancer. Thyroid stimulating hormone (TSH) was added to AR5 for thyroid cancer.
Established cancer cell lines are 1 gastric adenocarcinoma, 3 colorectal adenocarcinoma, 7 hepatocellular carcinoma, 2 breast ductal carcinoma, 7 renal cell carcinoma, 4 transitional cell carcinoma of urinary bladder, 2 glioblastoma multiforme, 1 oligodendroglioma, 1 gallbladder carcinoma, 2 pancreatic adenocarcinoma, 3 Wilms’ tumor, 1 lung cancer, 1 thyroid papillary cancer, 1 ovarian cancer, 1 ampulla of Vater adenocarcinoma and 1 metastatic squamous cell carcinoma of thigh. Another hepatocellular carcinoma line (SNU-182) initiated in June 1989 was established after 16 months.
AR5 media was useful especially for establishment of cell lines from hepatocellular carcinoma (success rate 36.8% [7/19]), pancreatic cancer (success rate 100% [2/2]) glioblastoma multiforme (success rate 100% [2/2]) and urologic cancers such as renal cell carcinoma (success rate 46.7% [7/15]), transitional cell carcinoma of urinary bladder (success rate 33.3% [4/12])and Wilms’ tumor (success rate 75.0% [3/4]).
Key Word: SNU cell lines
서 론
암 관련 연구에 있어서 신선한 조직표본을 사용하는 경우, 조직의 양이 적다든지，다시 실험을 하고자 할 때 조직이 부족하여 반복실험이 불가능하거나, 섬
유 세포 및 조직구등 다른 세포들이 함께 있어 순수한 암세포만을 요구하는 실험을 할 수가 없는등 여러가 지 문제점이 있다. 암세포주를 이용한 연구는 세포를 무한정 얻을 수 있고, 같은 실험을 반복할 수 있으며, 세포내의 살아있는 상태의 대사작용을 연구할 수 있고, 체내에서는 불가능한 조작을 할 수 있으며, 연구소간에 세포주를 교환할 수 있어 같은 재료로 연구를 할 수가 있다.
암세포주는 현재 암연구분야에서 활발히 연구되고 있는 분야인 암세포의 분화，암유전자의 발현, 항암제에 대한 감수성，방사선 치료에 대한 감수성, 항암
제에 대한 내성，암세포의 침습 및 전이, 암표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 항암효과, 암세포 성장 및 억제 인자와 세
포유전자 연구 등에 있어서 매우 유용하게 활용되고 있다.
본 저자들은 1982년부터 세포주를 개발하기 위하여 연구를 시작하였다. SNU4 위암세포주를 1984년 4월에 수립할 수 있었고, 누드 마우스의 이용과 더불어 배양 기술의 향상으로 1984년 3월부터 12월 사이에 SNU-C1, SNU-C2A (ATCC 250.1), SNU-C2B (ATCC 250), SNU-C4 및 SNU-C5 등 5종류의 대장암 세포주
를 수립하였다1). 1988년에 11예의 암세포주와 2예의 B-림프아구양 세포주의 수립을 보고하였고 1990년에는 22예의 암세포주와 3예의 B-림프아구양 세포주 등 SNU세포주 수립의 결과를 보고한 바 있다2, 3).
아직 해당 분야의 암 연구를 위하여 현재까지 국내에서 수립된 암세포주로는 절대적으로 미홉하며 각분야에서 여러 종류의 암 세포주를 필요로 하고 있어,
다양한 세포주들을 많이 수립하여 해당 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 계속 노력하고 있다.
본 연구에서는 1989년 11월부터 1990년 8월까지 사이에 206 예의 종양조직 (조직번호 283번부터 488번까지)으로부터 세포주 수립을 시도하여 1990년 11월까지 세포주 수립이 완료된 38(18.4%) 종류의 암세포주와 9종류의 B-림프아구양 세포주 및 1989년 6월에 배양을 시작하여 16개월간의 배양후 세포주로 수립된 1예의 간암세포주에 관하여 문헌고찰과 함께 보고하고자 한다.
연구 재료 및 방법
세포주 수립에 사용한 재료는 1989년 11월부터 1990년 8월까지 서울대학교병원에 입원한 종양환자들의 수술 중에 채취한 조직이거나 항암제 투여 목적으
로 입원중인 환자들의 흉수, 복수 등에서 얻었다. 고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용 하고 흉수, 복수 등은 원심 침전 시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다. 배양을 시도한 종양의 종류는 위암, 결장암, 갑상선암, 유방암, 간암, 췌장암, 백혈병, 자궁암, 난소암, 골육종, 폐암, 식도암, 신장암, 방광암, 후두암, 망막아세포종, 월름스 종양 및 신경아세포종 등 서울대학교병원에 입원하는 모든 암종류를 대상으로 하였다.
세포주 배양에 사용한 배지의 제조를 위하여는 RPML1640배지에 ACL-4(61) 배지 제조시에 첨가하는 인자들을 첨가하여 이 배지를 AR이라 부르고 56°C에서 30분간 가열하여 비동화시킨 우태혈청을 5%첨가하여 만든 배지를 AR5라 하였다. AR5배지의 조성은 Table 1과 같다. RPMI 용액에 비동화시킨 우태혈청을 10%첨가하여 만든 배지는 R10배지라 하였다. 위암조직의 배양에는 R10배지를 사용하였다. 갑상선암조직 외 배 양에는 AR5에 thyroid stimulating hormone (TSH)을 10ng/ml 첨가한 AR5T 배지를 사용하여 배양하였으며, 나머지 종양의 배양에는 모두 AR5를 사용하였다.
5%의 탄산가스와 95% 공기가 공급되고 적절한 습기가 유지되는 37°C 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 역위 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다. 종양세포가 잘 자라게 되면 계대배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존시켰다. 부유하여 자라는 세포 들은 그대로 모아 일부를 계대시키고 플라스크 바닥에 부착하여 자라는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기 단계에서 암세포와 함께 섬유아세포 등 간질세포들의 과다한 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별트립신 처리를 하거나 혈청이 함유된 성장인자 첨가 배지인 AR5 배지를 무혈청 배지인 ACL-4 배지로 일시 전환시켜 간질세포를 제거하도록 하였다.
결 과
1989년 11월부터 1990년 8월까지 10개월 간에, AR5, AR5T 및 R10 배지를 이용하여 38종류의 종양세포주와 9종류의 림프아구양 세포주를 수립할 수 있
었다 (Table 2, 3).
위암은 31예를 배양시도하여 R10 배지에서 1예(SNU-484; Fig. 39)를 수립할 수 있었다.
대장암은 18예를 배양시도하여 AR5 배지에서 3예(SNU-283; Fig. 2, SNU-479; Fig. 37)를 수립 하였다,
간세포암은 19예를 배양시도하여 AR5 배지에서 7예 (SNU-354; Fig. 15, SNU-368; Fig. 17, SNU-387; Fig. 21,SNU-398; Fig. 23, SNU423; Fig. 27, SNU-
449; Fig. 31, SNU-475; Fig. 35)를 수립 하였다.
유방암은 15예를 시도하여 2예 (SNU-306; Fig. 3,SNU-334; Fig. 11)를 수립하였다.
신장암은 15예를 시도하여 7예 (SNU-326; Fig. 8, SNU-328; Fig. 9, SNU-333; Fig. 10, SNU-349; Fig. 14, SNU-359; Fig. 16, SNU-376; Fig. 20, SNU-482; Fig.
38) 를 수립하였다.
방광암은 12예를 시도하여 4예 (SNU-342; Fig. 12,SNU-343; Fig. 13, SNU-396; Fig. 22, SNU-456; Fig.32)를 수립하였다.
뇌종양 중에는 다형성교아종을 2예 시도하여 2예 (SNU-444; Fig. 30, SNU-466; Fig. 34, SNU-466; Fig.34)를 수립하였으며 회돌기교종울 3예 시도하여 1예
(SNU-399 Fig. 24)를 수립 하였다.
월름스종양은 4예 시도하여 3예(SNU-426; Fig. 28, SNU-442; Fig. 29, SNU-458; Fig. 33)를 수립하였다.
폐암은 4예를 시도하여 1예 (SNU-371; Fig. 18)를 수립하였다.
갑상선 암은 AR5T 배지를 이용하여 5예중 1예 (SNU-373; Fig. 19)를 수립 하였다.
췌장암은 2예를 시 도하여 2예 (SNU-324; Fig. 7, SNU-410; Fig. 26)를 수립 하였다.
난소암은 4예중 1예 (SNU-323; Fig. 6)를 수립하였다.
담낭암은 2예를 시도하여 1예 (SNU.308; Fig. 4)를 수립하였다.
파터팽대부암은 1예를 시도하여 세포주(SNU-478; Fig. 36)가 되었으며 대퇴부의 전이성 편평상피암 1예도 배양하여 세포주 (SNU.316; Fig, 5)가 되었다. 그
이외에 배양을 시도하였으나 세포주가 수립되지 않았던 종양으로는 육종이 8예, 백혈병이 18예，림프종이 9예, 대장용종이 4예 그리고 기타 24예 등이었다
(Table 2). 간세포암 1예는 1989년 6월부터 16개월간의 배양후 세포주 (SNU-182, Fig. 1)로 수립되었다.
고 안
1988년 하반기부터는 ACL-4 배지에 우태혈청을 5% 첨가한 AR5 배지를 이용하여 일단온 모든 세포의 성장을 유도하고 그 후 섬유아세포의 과증식이 관찰되어 암세포의 성장이 억제될 때에는 감별 트림신 처리를 하거나 무혈청 배지인 ACL-4로 일시 바꾸어 배양하여 섬유아세포를 제거하도록 노력하여 직장암 세포주인 SWJ-61 과 대장암 세포주인 SNU-67을 수립하였다.
1988년 후반부터 1989년까지는 기본배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 배지가 좀더 이상적일 것이 라는 가정하에 R10 대신에 DF10과 AR5 대신에 ADF5배지를 사용하고 여성암의 배양에는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하여 갑상선암 세포주(SNU-80), 대장암 세포주 (SNU-81, SNU-175), 직장암 세포주 (SNU- 254), 난소암세포주 (SNU-119, SNU-445, SNU-251), 망막아세포종 세포주(SNU-125, SNU-426),자궁 근육종 세포주(SNU-135), 위 근육종 세포주 (SNU-141), 폐암 세포주 (SNU-160), 자궁 내막암 세포주(SNU-184), 뇌의 다형성교아종 세포주(SNU-201), 흑색종 세포주(SNU-207), 및 신장암 세포주(SNU-228, SNU-267)등 20종의 암세포주와 3종류의 B-림프아구양 세포주를 수립하여 보고한 바 있다3). 그 당시 보고한 후두암 세포주 (SNU-266)와 직장암세포주(SNU-280)는 계대 배양이 오래 진행되지 않아 세포주로 부를 수가 없게 되었다.
이번 연구에서의 암세포주의 성공율을 보면, AR-5배지가 간세포암(36.8%), 췌장암(100%), 신세포암(46.7%), 방광암(이행세포암)(33.3%) 및 월름스 종양(75%)외 수립에 특히 유용함을 알 수 있었다(Table 2).
위암세포주는 다른 장기의 암세포주보다 수립이 어려워 수립보고된 세포주의 수가 많지 않으며 대부분 일본에서 수립되었다4~12). Hojo5)는 1977년 MKN-L, 7, 28, 45, 74를 보고하였고, Sekiguchi 등9)은 1978년 흉수에서 KATO II，III를 수립보고하였다. 저자들도 이번 수립된 것을 포함하여 그간 SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484 등 모두 5개의 위암 세포주를 수립하였다. 1982년부터 1984년까지의 위암 세포주 수립 성공율 3.3%(1/30)에 비하여 아직 성공
율의 향상은 없어, 배양조건 개선 등에 대한 계속적인 연구가 필요하다. 결장암세포주는 문헌상 이미 80종류 이상이 보고되어 있다1, 13~23). 흑색종같은 종양은 배양하기 쉬운 반면, 갈색종이나 췌장의 소도(islet) 세포암은 배양이 아주 어렵다. 결장암의 경우는 그 중간에 해당되며, 부양층13), 영양소를 첨가한 혈청 함유 배지15), 콜라겐젤16) 사용 등 여러가지 배양기술이 응용되어 왔다. Rutzky와 Moyer17)는 결장암세포 배양의 성공울 위해서는, 종양을 처리할 때 효소를 사용하지 말고 가능한 적게 분해하고, 많은 수의 세포를 많이 이식하며, 섬유아세포는 일단 암세포가 자란 후 제거하고, 계대배양은 암세포가 증식되어 세포농도가 높아진후에 하는것이 좋다고 하였다. SNU세포주로는 SNU-C1, SNU-C2A, SNU-C2B，SNU-C4, SNU-61, SNU-67, SNU-70, SNU-81, SNU-254, SNU-283, SNU-407, SNU-479 등 14종류의 대장암 세포주가 수립되어, 이를 패널로 이용한 실험들이 이루어 질 수 있게 되었다.
역학적연구에서 간암과 B형 간염바이러스(HBV) 감염과는 밀접한 관계가 있음이 시사되었으며24, 25), 최근 분자생물학의 발전으로 B형간염 감염 환자에서
수립 된 PLC/PRF/5 나 HCC-M에서 HBV DNA 서열이 발견되어 HBV DNA가 간세포 DNA에 integrate 되는 것이 암세포화와 관계있으리라 여겨지고 있다26~28). PLC/PRF/5, DELSH-5, Hep 3B는 HBV DNA를 integrated form으로 가지며 HBsAg을배지에 분비 하고, FOCUS와 HCC-M은 HBV DNA를 integrated form으로 갖고있으나 HBsAg을 분비 하지는 않는 것으보 보고되어 있다29-33). 그러나 HBV감염의 증거가 없는 간경화 또는 만성간염환사에서도 간암이 발생하는데34) 이들 환자에서는 nonA-nonB 간염바이러스가 관계하리라 추정되고 있다. 따라서 HBV감염뿐만 아니라 NANB감염상태의 간세포암세포주에 대한 연구는 간염바이러스의 발암모델 및 NANB 간염바이러스의 연구에도 중요하다. 현재 수립된 SNU 간세포암세포주는 모두 8종류이며, 이들 간세포암 세포주 패널을 이용하여 성장인자에 대한 연구결과 insulin과 transferrin이 첨가된 배지가 간세포암 세포주의 수립에도 도움이 된다는 것을 알게 되었다35). 앞으로 이들 세포주들은 간암 발생과정의 분자생물학적 연구에 널리 활용될 것이다.
췌장선암세포주는 1963년 Dobrynin이 보고한4)이래 Lieber36),Owens37), Grant38), 등이 보고하였으며, 이들 췌관기원의 췌장선암세포주는 췌장효소 즉 아밀
레이스, 트립신, 카이모트립신 등을 분비하지 않으며39), 일부는 암태아성항원을 분비하는 세포주도 있다. 이번 수립된 SNU-324는 원발부위에서 SNU-410은 간전이 부위에서 수립된 세포주로 모두 체관선암에서 기원한 것이다.
담낭암 세포주는 특성분석과 함께 수립이 보고된것이 4개 정도 밖에 되지 않는다41-44). 이 중Johzaki41)가 보고한 FU-GBC-1은 분화도가 좋고 나머지는 모두 분화도가 나쁘다. FU-GBC-1은 암성복수에서 수립된 담낭선암 세포주로 CA19-9, 암태아성항원, 상피막항원(EMA)등의 상피종양항원을 발현한다. 이번 수립된 SNU-308은 중등도 분화도의 담낭선암에서 수립된 것으로 문헌상 보고된 세포주가 적은 것을 고려하면 귀중한 세포주라 사료된다.
유방암세포주는 1958년 Lafargues등의 보고이래, 일부 고형 침윤성 유관암에서 수립된 유방암 세포주의 보고도 있으나46-48), 대부분은 악성 늑막 삼출
액 45,49-53)에서 수립되었다. 악성 삼출액을 이용한 경우 암세포의 생존도가 높고(70%), 섬유아세포의 오염이 상대적으로 적은 잇점이 있다50). 이번 수립된 유
방암세포주 SNU-306, SNU-334는 원발부위에서 수립되었다. 이들 유방암세포주들은 여성호르몬의 영향등에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
신 세 포 암세포주는 1962년 Ishihara 등55) 이 처음으로 수립을 보고한 이래로 Giard 등56)이 9.5% (2/21) 의 세포주 수립 성공율을 보고하는 등 간헐적인 보고가 있다. Ebert 등57)은 1972~1987년까지 16년 동안 498예의 신세포암을 시도하여 63예(12.7%)의 세포주를 수립하였다고 보고하였다. 이중 46예는 원발부위에서 17예는 전이부위(폐，뇌, 뼈, 림프절)에서 수립되었으며, 세포주 수립 성공율은 원발부위와 전이부위 사이에 차이가 없었다고 하였다. 그러나 수립된 신세포암 세포주는 모두 임상적으로 아주 진행이 나쁜 종양에서 유래되었다고 하였다. 저자들의 경우는 AR5배지를 이용하여 15예를 원발부위에서 시도하여 7예
(46.7%)의 세포주 수립에 성공하여 높은 성공율을 보여 주고 있다, 문헌에 보고된 신세포암 세포주 중에는 에리트로포이에틴 을 지속적으로 분비하는 세포주 58)도있어, 에리트로포이에틴의 생성 및 분비과정에 대한연구에 이용될 수도 있다.
방광의 이행세포암 세포주는 30개 이상이 보고되어 있다59, 60). 저자들은 12예에서 시도하여 4예(33.3%) 성공하였으며, 이번 보고에서 보면 신세포암, 방광
암, 월름스 종양 등 특히 비뇨기계 종양의 수립 성공율이 높았다.
서울대학교 세포주 은행에서 보유하고 있는 74종류의 종양세포주들과 17종류의 림프아구양 세포주들(Table 4)은 추후 특성분석이 이루어진 후에 종양학
관련 연구분야에 광범위 하게 사용될 수 있을 것이다.
결 론
하였다.
AR5배지를 사용한 경우 암세포주의 성공율을 보면 간세포암이 36.8%, 췌장암이 100%, 다형성 교아종이100%, 신세포암이 46.7%, 방광암(이행세포암)이
33.3%, 그리고 월름스 종양이 75%로서 AR5배지는 이들 종양세포주의 수립에 유용함을 알 수 있었다.
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