『 SNU-1 ~ SNU-70 : 1984년 4월 ~ 1988년 7월』, 박재갑 외 19인, 無血淸 規定 塔地를 이용한 SNUH 세포주 수립 및 혈청 첨가 배지를 이용한 SNU 세포주 수립에 관한 연구, 대한암학회지, 1988;20:105-116.
Journal of Korean Cancer
Association 20, 2, November, 1988
= Abstract =
Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, and Departments of Surgery1,
Serum-free, defined medium ACL 4 has proven to be useful for the establishment and maintenance of human colorectal carcinoma and lung adenocarcinoma cell lines.
To determine the general usefulness of ACL-4 as a medium for establishing cell lines, we compared the growth of cells from many different tumor specimens in R10, ACL-4 and AR5 (ACL-4 plus 5% FBS). From June 1987 to July 1988, 69 specimens from a wide variety of human tumors were cultured
in R10 and ACL-4 or AR5. Eleven cancer cell lines were established, seven cell lines (4 stomach carcinoma, 1 rectal carcinoma, 1 ovarian carcinoma, 1 osteosarcoma) in R10; two cell lines (1 uterine cervical cancer, 1 laryngeal carcinoma) in ACL-4; and two cell lines in AR5 (1 colon carcinoma, 1 rectal carcinoma) (Table 1 & 2). Of interest, two B lymphoblastoid (non-neoplastic) cell lines were established from a stomach cancer and an acute myeloblastic leukemia specimen grown in ACL-4.
We have found that sodium pyruvate, transferrin, and insulin were very important for the growth of uterine cervical cancer cells. Early in this study, we also found that fibroblast growth was effectively suppressed by culturing tumor cells in the serum-free medium ACL-4. Therefore, in later attempts, when possible loss of cultures by fibroblast overgrowth was observed, serum containing media were replaced by ACL-4 to suppress and eventually eliminate the fibroblast contamination.
Although we were able to establish only 11 new cancer cell lines from 69 specimens, our study has extended the use of ACL-4 medium with or without serum for the growth of uterine cervical and laryngeal cancer cells.
•본 논문은 1987년도 서울대학교병원 대단위연구비 보조로 이루어진 것임.
암 관련 연구에 있어서 신선한 조직표본을 사용하는 데는 여러가지 제약이 따르게 된다. 조직의 양이 적다던지다시 실험을 하고자 할 때 조직이 부족하여 반복 실험이 불가능하다던지 섬유세포 및 조직구등 다른 세포들이 함께 있이 순수한 암 세포만을 요구하는 실험을 할 수가 없다던지 여러가지 문제점이 있다.
암 세포주는 현재 암 연구 분야에시 활발히 연구되고 있는 분야인 암 세포의 분화, 암 유전자의 발현, 항암제에 대한 감수성, 방사선 치료에 대한 감수성, 항암제에 대한 내성, 암세포의 침습 및 전이, 암 표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 항암효과, 암 세포 성장 및 억제 인자와 세포 유전자 연구 등에 있이서 매우 유용하게 활용되고 있어6, 7, 13, 19~24), 저자들은 암 조직의 근원이 확실 하면서 수립된 후 특성이 잘 분석될 수 있는 다양한 종류의 암 세포주를 수립하여 암 관련 연구분야의 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 그간 노력하여 왔으며 이미 대장암 세포주인 SNU-C1, SNU-C2A, SNUC2B, SNU-C4 및 SNU-C5를 수립하였고 그 세포주들의 각종 특성을 검사하여 이미 보고한 바 있다20).
암 세포주의 개발에 있어 기본 영양소인 염분, 당분, 아미노산 및 비타민 이외에도 세포의 번식에는 잘 규정되지 않은 생물학적 용액 및 추출물 등이 필요하다고 알려져 왔다. 이를 위해서는 가장 쉽게 구할 수 있고 보관이 편한 혈청이 이용되어 왔다. 그리나 어떤 세포들은 혈청을 함유한 배지에서 잘 배양이 되지 않는다. 혈청 함유 배양액이 어떤 암 세포의 배양에 필수적인 한 가지 또는 그 이상의 인자들이 결핍되어 있을 수 있고 또 어떤 암 세포들에는 혈청이 해롭게 작용할 수도 있다. 혈청에는 또 정상에서는 세포와 접촉되지 않는 물질들을 함유할 수도 있다. 여러 사람들의 연구결과 세포들의 번식에 중요한 호르몬이나 기타 인자들이 밝혀져 왔고 또 가장 적절한 농도도 규명되었다2). 또 특수한 종양 세포의 배양을 위해 규정된 배지도 개발되어 왔는데 이러한 규정 배지들은 일반적으로 섬유세포의 발육보다는 암세포들의 발육을 더 잘하게 하여 세포주 수립의 성공율을 높일 수 있는 것으로 보고되어 있다2~5, 7, 8, 11, 15, 18, 20, 29).
규정 배지인 ACL(adenocarcinoma of lung)-4 배지는 비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 것이나4, 5, 8) 대장암 세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한 것으로 보고되었다8, 11, 20).
저자들은 각종 종양 조직으로부터 새로운 세포주를 수립하기 위하여 일차 단계에서는 규정배지인 ACL-4를 사용하면서 대조 배지로는 동시에 R10 (RPMI-1640 배지에 56°C에서 30분간 가열하여 비활성화 시킨 우태혈청 10%를 첨가한 배지)을 사용하였으며 이차 단계에서는 AR5 (ACL-4배지에 비활성화시킨 우태 혈청 5%첨가)를 사용하면서 대조 배지로는 R10을 사용하였다.
현재까지 95예의 종양 조직으로부터 세포주 수립을 시도하였으며 계속 새로운 세포주 수립을 위한 노력이 진행중이고 아직도 세포주의 수립단계에 있는 예들이 많아 더 장기간의 실험 기간이 지난후에는 세포주 수립의 성공율을 더 높게 보고할 수 있 것으로 사료되나 이미 수립된 세포주의 중요성과 아울러 이 세포주들을 다른 연구원들에게 분양하여줄 때 기초 참고문헌이 요청되므로 저자들은 1988년 7월까지 시도한 69예의 종양 조직으로부터 현재까지 세포주 수립이 완료된 11종류의 세포주에 관하여 일차보고를 하고자 한다.
실 험 방 법
체외 배양에 사용한 사람 종양 조직은 모두 서울대학교병원에 입원한 종양환자들의 수술중에 채취한 조직이거나 항암제 투여 목적으로 입원중인 환자들의 흉수, 복수 및 심낭수에서 얻었다.
고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용하였고 흉수, 복수 및 심낭수 등은 원심 침전 시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다.
25cm2 플라스크에 약 1—5X106개의 세포가 들어가도록 분주하였다. 48예에서는 ACL-4와 R10 배지를 사용하였으며 후반기의 21예에서는 AR5와 R10을 사용하였다. 종양 세포가 너무 많이 자라면 계대 배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존 시켰다. 부유하여 자라는 세포들은 그대로 모아 일부를 계대 시켰으며 플라스크 바닥에 붙어 가라앉는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기 단계에서 간질 세포들의 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별트립신 처리를 하였다. AR5 배지 사용시 간질 세포들의 성장이 관찰되면 배지를 ACL-4로 일시 전환시켜 간질 세포를 제거하도록 노력하였다.
RPMI-1640 배지와 혈청은 GIBCO(Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, U.S.A.)로 부터 구입하였다. 5%의 탄산가스와 95% 공기가 공급되고 적절한 습기와 37°C가 유지되는 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다.
몇가지 세포주에서는 세포들의 성장 속도를 측정하기 위하여 0.5〜3X105개의 살아 있는 세포들을 25cm2 플라스크에 분주하고 매일 혹은 3일마다 2주 내지 그 이상의 기간동 세포의 수를 측정하여 세포의 수가 2배로 늘어 나는 시간을 산출하였다.
SNU-1, SNU-5 및 SNU-16 위암 세포주에서는 B림프구나 다른 림프구로 오염되어 있지 않는지를 보기위하여 0.5 mW power에시 488 nm 파장을 이용하는 FACS II flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 세포표면항원을 간접면역형광법으로 염색 후 immunophenotyping을 시행하였다. 사용된 단세포군 항체는 B1 (CD20, pan B 세포, Coulter), B2 (CD21, CR2수용체, Coulter), B4 (CD19, pan B세포, Coulter). T11 (CD2, pan T세포, Ortho)와 Leu 9(CD7, pan T세포, Becton Dickinson)이였다.
림프아구양 세포주 (lymphoblastoid cell line) 인 SNUH-9와 SNUH-20에 대해서는 T 및 B 림프구와 과립구 계열 세포에 대한 각종 세포표지를 검사하였다. 각종 세포표지의 특성은 표 3과 같다. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 는 Bethesda kit (Bethesda Research Laboratories)을 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면면역글로브린 (Smlg)은 FITC-conjugated anti-human immunoglobulins (IgG + IgA + IgM)(Cappel 사)을 이용하여 직접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면항원은 7종의 단세포군항체 (T1, T11, I2, B4, J5, MY9, MY7)를 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 이들 각종세포표지 검사의 결과는 형광현미경 (Nikon 사)하에서 100개의 세포를 관찰하여 형광양성 세포의 백분율로 결과를 표시하였다.
규정배지인 ACL-4를 이용하여 수립된 세포주는 SNUH (서울대학교병원, Seoul National University Hospital)의 약자를 사용하기로 하고 우태혈청이 함유된 배지인 AR5나 R10을 이용하여 수립된 세포주는 SNU(서울대학교)의 약자를 사용하기로 하였다. 1984년 4월 11일 R10을 이용하여 위암의 원발 조직으로 부터 수립한 위암 세포주를 이미 SNU-1으로 명명하였으므로 본 실험에서는 각 조직에서 세포주 수립을 시도할 때마다 2번부터 차례로 번호를 부여하고 세포주가 수립되면 그 번호를 그대로 SNU(H)-뒤에 붙이어 그 세포주의 명칭으로 삼았다.
1987년 6월부터 9월까지 48예의 종양 조직으로부터 ACL-4와 R10을 이용하어 세포주 수립을 시도하였고 1988년 4월부터 7월까지 21예의 종양조직으로부터 AR5와 R10을 이용하여 세포주 수립을 시도하였다. 표 1과 표 2에서와 같이 1987년 48예의 종양 조직으로 부터 ACL-4배지를 이용하여 급성 골수아성 백혈병 환자의 흉수로부터 수립된 B 림프아구양 세포주인 SNUH-9, 자궁 경부 편평상피세포암으로부터 유래된 세포주인 SNUH-46, 위암 환자의 복수로부터 유래된 B 림프아구양 세포주인 SNUH-20 및 후두 편평상피세포 암으로부터 유래된 세포주인 SNUH-46을 수립하였고, R10 배지를 이용하여서는 위선암 세포주인 SNU-5 및 SNU-16과 난소의 유두상 장애성 낭선암종 (papillary serous cystadenocarcinoma)에서 유래한 SNU-8 및 대퇴골 골수암 유래 세포주인 SNU-47을 수립할 수 있었다.
SNU-8 난소암 세포주는 1987년 7월 일차 시도에서 세포주 수립에 실패하였으나 동결 보존 시켰던 복수를 다시 1988년 4월 녹여 R10배지에서 수립에 성공하였다. 후두암 세포주인 SNUH-46은 ACL-4배지를 이용하어 수립되있으나 수립된 후는 R10배지에서 더 빨리 성장하는 것을 알 수 있있다. R10배지에서는 수립 초기 단계에 섬유세포의 과증식으로 세포주를 수립할 수 없었으나 ACL-4에서는 섬유세포의 성장이 거의 관찰되지 않았다.
1988년에 21예의 종양 조직으로부터 AR5배지를 이용하여 직장암 세포주인 SNU-61과 대장암 세포주인 SNU-67을 수립할 수 있었으며 R10배지를 이용해서는 위선암 세포주인 SNU-55 및 SNU-64와 직장암 세포주인 SNU-70을 수립할 수 있있다.
SNU-61 직장암 세포주는 직장암 수술후 간에 전이가 발생하여 간절제후 전이 조직으로 부터 수립된 세포주로서 R10보다는 AR5에서 빠른 성장을 하였으며 일부 섬유아세포의 오염을 제거하기 위하여 ACL-4에서 수 주간 배양을 하였다.
SNU-67 대장암 세포주는 대장암 수술후 역시 간전이가 있어 간절제후 전이 조직으로 부터 수립되었는데 R10보다는 AR5에서 더 빨리 자랐으며 섬유아세포의 제거를 위하여 수 주간 ACL-4에서 유지시켰다. SNU-5, SNU-16, SNU-55 및 SNU-64등 위암 세포주들은 모두 R10을 이용하여 수립이 되었는데 ACL-4에서 성장이 잘 되지 않는 반면에 R10에서 잘 자라는 점으로 보아 ACL-4에 들어있지 않고 혈청에 있는 어떤 인자가 성장에 필요한 것으로 생각할 수 있다. SNU-5, SNU-16 및 SNU-1에 대하여는 이미 여러 가지 특성 분석이 완료되어 NCI-N87(미국 국립암 연구소에서 수립한 위암세포주) 위암 세포주와 함께 별도로 보고할 예정이다24).
특이한 점은 SNU-16 위암 세포주의 DNA에는 c-myc 유전자가 대단히 증폭(amplify)되어 있다는 점으로서, 현재까지의 위암 조직 및 누드 마우스에 계대되어온 위암 조직 몇 예에서 c-myc 유전자가 증폭된 것 이 보고되긴 하였으나 위암 세포주에서 c-myc 유전자가 중폭된 것이 발견된 것은 문헌상 찾아볼 수 없었다는 점이다24).
SNU-5(Fig. 1), SNUH-9 (Fig. 3), 및 SNUH-20 (Fig. 7) 세포주의 대부분 세포들은 부유하며 자라고 SNU-8(Fig. 2), SNUH-17(Fig. 5, 6), SNUH-46(Fig. 8, 9), SNU-47(Fig. 10), SNU-55(Fig. 11), SNU-61(Fig. 12), SNU-64(Fig. 13), SNU-67(Fig. 14,15) 및 SNU-70{Fig. 16) 세포주의 세포들은 배양 플라스크바닥에 부착하여 자라는 성질을 갖고 있으며 SNU-16 (Fig. 4) 세포주는 바닥에 붙거나 부유하며 자라고 있다.
ACL-4에서 배양이 된 세포주들은 모두 R10에서 배양이 가능하였으나 SNUH-17세포주는 R10에 배양할 수 있도록 적응시키는데 수 주 동안이 소요되었다. ACL-4배지 속의 어느 인자가 이 세포주의 성장에 중요한 지를 실험해본 결과 sodium pyruvate가 매우 중요하다는 사실과 함께 기본 배지에 sodium pyruvate, transferrin 및 인슐린을 첨가할 경우 SNUH-17 및 Hela 세포주의 성장이 ACL-4에서와 큰 차이가 없음이 발견되었으며1) RPMI 1640에 이 세가지 인자가 첨가된 배지 (R-TIP으로 부르기로 함)에서 SNUH-17 및 Hela 세포주가 장기간 계속 잘 자라는 것이 증명되었다.
세포주의 성장 속도를 세포의 수가 2배로 늘어나는 시간으로 표시할 때 SNU-5는 R10배지에서 34시간, SNUH-9은 ACL-4배지에서 39시간, SNU-16은 R10 배지에서 27시간, SNUH-17 세포주는 ACL-4배지에서 40시간이고 R10배지에서 64시간이었며, SNUH-20은 ACL-4배지에서 40시간이었고 SNU-47은 R10 배지에서 82시간이었다. SNU-1, SNU-5 및 SNU-16 위암 세포주는 flow cytometry를 이용한 immunophenotyping상 어느것도 B세포 혹은 T세포 표지인자와 반응을 보이지 않았으므로 EBV-transformed B세포나 혹은 다른 림프계 세포로 오염되어 있지 않음을 알 수 있었다. 림프아구양 세포주인 SUNH-9와 SNUH-20 세포주는 큰 세포 덩어리(clumps)를 형성하며 부유되어 자라고 세포 형태 관찰을 위해 cytocentrifuge(Shandon 사)를 이용하여 유리슬라이드에 세포원침 도말표본을 만들어 Wright 염색을 한 결과는 Fig. 3,7과 같다. 두 세포주 모두에서 각 세포주 구성 세포의 형태와 크기는 매우 다양하였으나 두 세포주 간에 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. 핵은 대개 원형 내지 난원형이고 때로 함몰된 부위가 있었고 흔히 크고 뚜렷한 핵소체를 가지고 있었다. 세포질의 양은 중등도 내지 풍부한 편이었으며 연한 푸른색 내지 진한 푸른색을 띠었고 때로 세포질내 공포가 관찰되었다. 이러한 형태는 일반적으로 림프아구양 세포주에서 볼 수 있는 형태에 합당한 소견이었다.
SNUH-9과 SNUH-20 두 세포주 모두 세포표지검사에서 I2(HLA-DR), B4(B cell specific antigen) 및 Smlg에 양성반응을 나타내 Smlg 양성인 B 림프구 계열의 세포주(B lymphoblastoid cell line)인 것으로 확인되었다(Table 3).
고 안
비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 규정 배지인 ACL-4는 비소세포 폐암 이외에 대장암세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한 것으로 보고되었다11, 20).
세포 배양시에 호르몬, 영양소, 결합 단백질 및 부착 인자등의 보충을 위해 RPMI-1640과 같은 기본 배지에 첨가 하여주는 우태혈청을 넣지 않고 세포를 배양하고자 할 때에는 일반적으로 그 세포의 성장에 필요한 인자들을 따로 첨가해 주어야 한다. 폐 선암 세포주 및 대장암 세포주들을 서서히 적응 시키면 아무런 성장 인자의 보충 없이도 기본 배지에서 키울 수 있음이 보고되었으나6) 새로운 세포주의 수립에는 반드시 성장 인자들의 첨가가 필수적이다.
ACL-4에 함유된 인자들에는 ① 대부분 세포들의 성장에 필요한 것으로 알려진 인슐린(20 ug/ml) ② 철-결합 혈청 단백질이며 때로는 배지내의 미량의 독성 금속원소들을 제거하는 해독 단백질로도 알려져 있고 거의 모든 세포의 성장에 필요한 transferrin(10 ug/ml)3) ③ 필수 영양소이며 glutathione peroxidase속에 효소 구성 성분 및 활성제로서 존재하고 무혈청 배지내에서 세포주의 장기간 성장에 필요한 것으로 알려 진 셀레늄25, 27, 28, 31)이 sodium selenite(25nM)로서 들어 있고 ④ 무혈청 배지내에서 Hela(인체 자궁암), MDCK(개의 신장), ZR-75-1인체 유방암), RF-1(쥐 난소), HC84S(인체 대장암) 및 L6(쥐 myoblast) 세포주의 성장에 도움을 준 것으로 알려진 hydrocortisone2) (50 nM), ⑤ 무혈청 배지내에서 Hela, MCF-7(인체 유방암), TM4(생쥐 고환), HC84S, HLE222(사람폐 상피양 암) 및 BHK(hamster 신장 섬유아세포) 세포주의 성장에 필요한 epidermal growth factor2) (1 ng/ml), ⑥ 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세포막 phospholipid의 주요 구성 요소의 하나인 phosphatidyl ethanolamine을 합성 하는데 기질로 사용되며 무혈청 배지에서 유방 상피 세포, 쥐의 hybridoma와 사람의 epidermal keratinocyte를 자라게 하는 데 필요한 ethanolamine과 phosphoryl ethanolamine(각각 10uM)15), ⑦ 무혈청 배지에서 GH3(쥐의 뇌하수체 암), MDCK, ZR-75-1, HC84S 및 HLE222 세포주의 성장을 잘하게 하는 T3 (triiodothyronine, 100 pM)2) ⑧ 림프구 세포막의 구조적 integrity를 유지하는데 필요하다고 알려진 알부민은 여기에 결합된 지방산이 배양시 세포막의 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 하며 또 알부민 자체가 미량의 성장 인자와 호르몬을 수반할 수 있으며 또 배지내 미량의 억제인자들을 결합하여 그들의 활동을 차단하는 역할을 하고14, 18, 26, 30), 배지 1 ml에 5 mg의 알부민을 첨가하면 10%혈청이 첨가된 배지에서 발견되는 농도와 같은데 ACL-4에는 1 ml의 배지에 2 mg의 우혈청 알부민이 첨가되었고 ⑨ 액체 배지에서 불안정한 글루타민을 2mM첨가하고 ⑩ 세포 배양시 세포수가 적을 때 에너지 원으로 유용한 sodium pyruvate12, 17)가 RPMI-1640 배지에는 들어 있지 않으므로 0.5 mM농도로 첨가되어있고 ⑪ 완충 기능을 갖는 혈청이 없는 것을 보충하기 위해 Hepes buffer가 10 mM첨가되어 있다.
SNUH-9은 급성골수성백혈병 환자의 흉수에서, SUNH-20은 위암 환자의 복수에서 수립된 B-림프아구양 세포주이다.
B 림프구 계열의 세포주(B-lymphoid cell lines)는 세포주의 기원(origin) 에 따라 크게 두가지로 구분된다. 즉 백혈병, 악성림프종 등의 악성 종양에서 기원된 것과 비종양성의 정상 림프구에서 기원된 림프아구양 세포주의 두가지이다.
림프아구양 세포주 (B-lymphoblastoid cell lines)는 혈청학적으로 Epstein-Barr virus (EBV) 양성인 정상인 또는 악성 종양환자의 혈액, 골수, 림프조직 등으로 부터 매우 높은 빈도로 쉽게 세포주를 만들 수가 있다. 이 경우에 B 림프아구양 세포주는 대개 악성종양 세포가 아닌, EBV를 함유하고 있는 정상세포군(clone)으로 부터 기원하며 다음과 같은 몇가지 특징이 있다16). 형태학적으로 큰 세포 덩어리(clumps)를 형성하며 자라고 림프아구의 형태를 취하며 한 세포주 내의 구성 세포간에는 크기와 형태의 변화가 심하나 B 림프아구양 세포주의 서로 다른 세포주 간에는 형태학적 차이가 없다. 세포의 분화 단계는 intermediate B cell 단계에 속하며 세포질면역글로부린(CIg)과 세포표면면역글로부린(Smlg)을 표현하고, 분비하는 면역글로부린은 악성종양 유래 B-림프구 계열 세포주와 달리 polyclonal한 것이 특징이다.
본 연구에서 수립한 SNUH-9과 SNUH-20세포주는 상기한 형태학적 특징을 가지고 있으며 세포표지 검사상 I2(HLA-DR), B4(Bcell특이항원) 및 Smlg양성의 결과를 보여 B림프구에서 기원한 세포주임이 확인되었다.
무혈청 규정배지인 ACL-4는 이미 알려진대로 섬유세포의 성장을 억제하면서 대장암 및 직장암 세포의 성장을 가능케 하였다. 본 실험에서는 자궁경부암과 후두암 세포주의 수립에 ACL-4가 유용하게 사용될 수 있음을 알아내었다. 흥미롭게도 ACL-4 배지는 B-림프아구양 세포의 성장을 잘하게 하였는데 ACL-4는 많은 폐 종양표본에서 B 림프아구양 세포들의 성장에도 효과가 있으며(H.K, Oie와 의견 교환) 인체 myeloma 세포주의 수립에도 성공적으로 사용되었음이 보고되었다9).
본 실험의 초기단계에 나타났듯이 ACL-4 배지가 모든 종양세포의 배양에 유용한 것은 아니었으므로 앞으로는 초기에는 혈청이 첨가된 배지인 AR5 배지를 사용하여 암세포의 성장을 유도하고 그후 섬유세포를 제거하기 위하여 감별 트립신 처리나 무혈청 배지의 사용을 하는 것이 좋을 것으로 사료된다.
아직 까지 세포주로서 확립 되진 않았으나 계속 살아서 서서히 성장하는 조직들에 대하여는 세포주가 수립되면 추후 다른 기회 에 보고할 예정이다.
앞으로 본 논문에 보고된 세포주들에 대한 여러가지 특성 분석이 이루어 짐과 아울러 이 세포주들이 여러 관련분야 연구원들에 의하여 널리 활용되기를 기대한다.
여러 종류의 암 세포주 수립을 위한 ACL-4의 유용성을 알아보기 위하여 여러가지 종양 조직을 R10, ACL-4 및 AR5 배지내에서 배양하여 비교하였다. 11 종류의 암세포주가 수립되었는데 R10에서 7가지의 세포주 (위암 4, 직장암 1, 난소암 1, 골육종 1), ACL-4에서 2종류의 세포주 (자궁암 1, 후두암 1), AR5 배지에서 2종류 (대장암 1, 직장암 1)의 세포주를 수립할 수 있었다.
흥미로운 것은 위암환자와 급성골수성 백혈병 환자로부터 2종류의 비종양성 B 림프아구양 세포주가 수립된 점이다.
본 연구의 전반기에 섬유아세포의 성장이 무혈청배지인 ACL-4에서 효과적으로 억제되는 것을 발견하였으므로 후반기에는 섬유아세포의 과증식으로 암 세포의 배양이 소실될 우려가 있을 때는 혈청을 함유한 배지를 ACL-4로 바꾸어 섬유아세포를 제거하도록 노력하였다.
69예의 종양으로부터 현재까지 단 11종류의 새로운 세포주를 수립하였지만 본 연구에서는 혈청함유 여부에 무관하게 ACL-4 배지가 자궁암 및 후두암 세포를 배양하는데 사용될 수 있음을 알게되었다.
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無血淸 規定 塔地를 이용한 SNUH 세포주 수립 및
혈청 첨가 배지를 이용한 SNU 세포주
수립에 관한 연구*
서울 大學校 醫科大學 癌 硏究所 騰癌 細胞學 硏究室 및 外科1，內科2, 産婦人科3, 整形外科4 , 胸部外科5,
犯尿器科6, 耳鼻唱候科7, 臨床病理科8, 病理科9, 미국 국립암연구소 및 해군병원10
朴在甲1 • 權男滿1 • 金鑛福1 • 吳承根1 • 奉健組1 • 複國鑛1 • 金洙奉1
方英往2 • 金潞經2 • 姜淳範3 • 申最雨3 • 李痛藏4
金周顯5 • 李寒補6 • 金光顯7 • 朴明繼8 • 金勇一9
허버트 오이10 • 제인 트레펠10 • 아디 가즈다10
= Abstract =
Establishment of SNUH Cell Lines in Serum-free Defined Medium and
SNU Cell Lines in Serum Supplemented Medium
Jae-Gahb Park, M.D1., Nam-Sook Kwon1, Jin-Pok Kim, M.D1., Seung-Keun Oh, M.D1
Kuhn Uk Lee, M.D1., Kuk Jin Choe, M.D1., Soo Tae Kim, M.D1., Yung Jue Bang, M.D2
Noe Kyeong Kim, M.D2., Soon Beom Kang, M.D3., Myon Woo Shin, M.D.3, Sang Hoon Lee, M.D.4
Joo Hyun Kim, M.D.5, Chong Wook Lee, M.D.6, Kwang Hyun Kim, M.D.7, Myoung Hee Park, M.D.8
Yong II Kim, M.D.9, Herbert K. Oie, Ph.D.10, Jane Trepel10, and Adi F. Gazdar, M.D.10
Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, and Departments of Surgery1,
Internal Medicine2, OB & GYN3, Orthopedic Surgery4, Thoracic Surgery5, Urology6
Otolaryngology7, Clinical Pathology8, and Pathology9, College of Medicine,
Otolaryngology7, Clinical Pathology8, and Pathology9, College of Medicine,
Seoul National University, Seoul, 110-744, Korea, and NCI-Navy Medical Oncology Branch,
National Cancer Institute and Naval Hospital10, Bethesda, Maryland, 20814, U.S.A.
Serum-free, defined medium ACL 4 has proven to be useful for the establishment and maintenance of human colorectal carcinoma and lung adenocarcinoma cell lines.
To determine the general usefulness of ACL-4 as a medium for establishing cell lines, we compared the growth of cells from many different tumor specimens in R10, ACL-4 and AR5 (ACL-4 plus 5% FBS). From June 1987 to July 1988, 69 specimens from a wide variety of human tumors were cultured
in R10 and ACL-4 or AR5. Eleven cancer cell lines were established, seven cell lines (4 stomach carcinoma, 1 rectal carcinoma, 1 ovarian carcinoma, 1 osteosarcoma) in R10; two cell lines (1 uterine cervical cancer, 1 laryngeal carcinoma) in ACL-4; and two cell lines in AR5 (1 colon carcinoma, 1 rectal carcinoma) (Table 1 & 2). Of interest, two B lymphoblastoid (non-neoplastic) cell lines were established from a stomach cancer and an acute myeloblastic leukemia specimen grown in ACL-4.
We have found that sodium pyruvate, transferrin, and insulin were very important for the growth of uterine cervical cancer cells. Early in this study, we also found that fibroblast growth was effectively suppressed by culturing tumor cells in the serum-free medium ACL-4. Therefore, in later attempts, when possible loss of cultures by fibroblast overgrowth was observed, serum containing media were replaced by ACL-4 to suppress and eventually eliminate the fibroblast contamination.
Although we were able to establish only 11 new cancer cell lines from 69 specimens, our study has extended the use of ACL-4 medium with or without serum for the growth of uterine cervical and laryngeal cancer cells.
•본 논문은 1987년도 서울대학교병원 대단위연구비 보조로 이루어진 것임.
서 론
암 관련 연구에 있어서 신선한 조직표본을 사용하는 데는 여러가지 제약이 따르게 된다. 조직의 양이 적다던지다시 실험을 하고자 할 때 조직이 부족하여 반복 실험이 불가능하다던지 섬유세포 및 조직구등 다른 세포들이 함께 있이 순수한 암 세포만을 요구하는 실험을 할 수가 없다던지 여러가지 문제점이 있다.
암 세포주는 현재 암 연구 분야에시 활발히 연구되고 있는 분야인 암 세포의 분화, 암 유전자의 발현, 항암제에 대한 감수성, 방사선 치료에 대한 감수성, 항암제에 대한 내성, 암세포의 침습 및 전이, 암 표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 항암효과, 암 세포 성장 및 억제 인자와 세포 유전자 연구 등에 있이서 매우 유용하게 활용되고 있어6, 7, 13, 19~24), 저자들은 암 조직의 근원이 확실 하면서 수립된 후 특성이 잘 분석될 수 있는 다양한 종류의 암 세포주를 수립하여 암 관련 연구분야의 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 그간 노력하여 왔으며 이미 대장암 세포주인 SNU-C1, SNU-C2A, SNUC2B, SNU-C4 및 SNU-C5를 수립하였고 그 세포주들의 각종 특성을 검사하여 이미 보고한 바 있다20).
암 세포주의 개발에 있어 기본 영양소인 염분, 당분, 아미노산 및 비타민 이외에도 세포의 번식에는 잘 규정되지 않은 생물학적 용액 및 추출물 등이 필요하다고 알려져 왔다. 이를 위해서는 가장 쉽게 구할 수 있고 보관이 편한 혈청이 이용되어 왔다. 그리나 어떤 세포들은 혈청을 함유한 배지에서 잘 배양이 되지 않는다. 혈청 함유 배양액이 어떤 암 세포의 배양에 필수적인 한 가지 또는 그 이상의 인자들이 결핍되어 있을 수 있고 또 어떤 암 세포들에는 혈청이 해롭게 작용할 수도 있다. 혈청에는 또 정상에서는 세포와 접촉되지 않는 물질들을 함유할 수도 있다. 여러 사람들의 연구결과 세포들의 번식에 중요한 호르몬이나 기타 인자들이 밝혀져 왔고 또 가장 적절한 농도도 규명되었다2). 또 특수한 종양 세포의 배양을 위해 규정된 배지도 개발되어 왔는데 이러한 규정 배지들은 일반적으로 섬유세포의 발육보다는 암세포들의 발육을 더 잘하게 하여 세포주 수립의 성공율을 높일 수 있는 것으로 보고되어 있다2~5, 7, 8, 11, 15, 18, 20, 29).
규정 배지인 ACL(adenocarcinoma of lung)-4 배지는 비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 것이나4, 5, 8) 대장암 세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한 것으로 보고되었다8, 11, 20).
저자들은 각종 종양 조직으로부터 새로운 세포주를 수립하기 위하여 일차 단계에서는 규정배지인 ACL-4를 사용하면서 대조 배지로는 동시에 R10 (RPMI-1640 배지에 56°C에서 30분간 가열하여 비활성화 시킨 우태혈청 10%를 첨가한 배지)을 사용하였으며 이차 단계에서는 AR5 (ACL-4배지에 비활성화시킨 우태 혈청 5%첨가)를 사용하면서 대조 배지로는 R10을 사용하였다.
현재까지 95예의 종양 조직으로부터 세포주 수립을 시도하였으며 계속 새로운 세포주 수립을 위한 노력이 진행중이고 아직도 세포주의 수립단계에 있는 예들이 많아 더 장기간의 실험 기간이 지난후에는 세포주 수립의 성공율을 더 높게 보고할 수 있 것으로 사료되나 이미 수립된 세포주의 중요성과 아울러 이 세포주들을 다른 연구원들에게 분양하여줄 때 기초 참고문헌이 요청되므로 저자들은 1988년 7월까지 시도한 69예의 종양 조직으로부터 현재까지 세포주 수립이 완료된 11종류의 세포주에 관하여 일차보고를 하고자 한다.
실 험 방 법
체외 배양에 사용한 사람 종양 조직은 모두 서울대학교병원에 입원한 종양환자들의 수술중에 채취한 조직이거나 항암제 투여 목적으로 입원중인 환자들의 흉수, 복수 및 심낭수에서 얻었다.
고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용하였고 흉수, 복수 및 심낭수 등은 원심 침전 시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다.
25cm2 플라스크에 약 1—5X106개의 세포가 들어가도록 분주하였다. 48예에서는 ACL-4와 R10 배지를 사용하였으며 후반기의 21예에서는 AR5와 R10을 사용하였다. 종양 세포가 너무 많이 자라면 계대 배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존 시켰다. 부유하여 자라는 세포들은 그대로 모아 일부를 계대 시켰으며 플라스크 바닥에 붙어 가라앉는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기 단계에서 간질 세포들의 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별트립신 처리를 하였다. AR5 배지 사용시 간질 세포들의 성장이 관찰되면 배지를 ACL-4로 일시 전환시켜 간질 세포를 제거하도록 노력하였다.
RPMI-1640 배지와 혈청은 GIBCO(Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, U.S.A.)로 부터 구입하였다. 5%의 탄산가스와 95% 공기가 공급되고 적절한 습기와 37°C가 유지되는 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다.
몇가지 세포주에서는 세포들의 성장 속도를 측정하기 위하여 0.5〜3X105개의 살아 있는 세포들을 25cm2 플라스크에 분주하고 매일 혹은 3일마다 2주 내지 그 이상의 기간동 세포의 수를 측정하여 세포의 수가 2배로 늘어 나는 시간을 산출하였다.
SNU-1, SNU-5 및 SNU-16 위암 세포주에서는 B림프구나 다른 림프구로 오염되어 있지 않는지를 보기위하여 0.5 mW power에시 488 nm 파장을 이용하는 FACS II flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 세포표면항원을 간접면역형광법으로 염색 후 immunophenotyping을 시행하였다. 사용된 단세포군 항체는 B1 (CD20, pan B 세포, Coulter), B2 (CD21, CR2수용체, Coulter), B4 (CD19, pan B세포, Coulter). T11 (CD2, pan T세포, Ortho)와 Leu 9(CD7, pan T세포, Becton Dickinson)이였다.
림프아구양 세포주 (lymphoblastoid cell line) 인 SNUH-9와 SNUH-20에 대해서는 T 및 B 림프구와 과립구 계열 세포에 대한 각종 세포표지를 검사하였다. 각종 세포표지의 특성은 표 3과 같다. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 는 Bethesda kit (Bethesda Research Laboratories)을 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면면역글로브린 (Smlg)은 FITC-conjugated anti-human immunoglobulins (IgG + IgA + IgM)(Cappel 사)을 이용하여 직접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면항원은 7종의 단세포군항체 (T1, T11, I2, B4, J5, MY9, MY7)를 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 이들 각종세포표지 검사의 결과는 형광현미경 (Nikon 사)하에서 100개의 세포를 관찰하여 형광양성 세포의 백분율로 결과를 표시하였다.
규정배지인 ACL-4를 이용하여 수립된 세포주는 SNUH (서울대학교병원, Seoul National University Hospital)의 약자를 사용하기로 하고 우태혈청이 함유된 배지인 AR5나 R10을 이용하여 수립된 세포주는 SNU(서울대학교)의 약자를 사용하기로 하였다. 1984년 4월 11일 R10을 이용하여 위암의 원발 조직으로 부터 수립한 위암 세포주를 이미 SNU-1으로 명명하였으므로 본 실험에서는 각 조직에서 세포주 수립을 시도할 때마다 2번부터 차례로 번호를 부여하고 세포주가 수립되면 그 번호를 그대로 SNU(H)-뒤에 붙이어 그 세포주의 명칭으로 삼았다.
결 과
1987년 6월부터 9월까지 48예의 종양 조직으로부터 ACL-4와 R10을 이용하어 세포주 수립을 시도하였고 1988년 4월부터 7월까지 21예의 종양조직으로부터 AR5와 R10을 이용하여 세포주 수립을 시도하였다. 표 1과 표 2에서와 같이 1987년 48예의 종양 조직으로 부터 ACL-4배지를 이용하여 급성 골수아성 백혈병 환자의 흉수로부터 수립된 B 림프아구양 세포주인 SNUH-9, 자궁 경부 편평상피세포암으로부터 유래된 세포주인 SNUH-46, 위암 환자의 복수로부터 유래된 B 림프아구양 세포주인 SNUH-20 및 후두 편평상피세포 암으로부터 유래된 세포주인 SNUH-46을 수립하였고, R10 배지를 이용하여서는 위선암 세포주인 SNU-5 및 SNU-16과 난소의 유두상 장애성 낭선암종 (papillary serous cystadenocarcinoma)에서 유래한 SNU-8 및 대퇴골 골수암 유래 세포주인 SNU-47을 수립할 수 있었다.
SNU-8 난소암 세포주는 1987년 7월 일차 시도에서 세포주 수립에 실패하였으나 동결 보존 시켰던 복수를 다시 1988년 4월 녹여 R10배지에서 수립에 성공하였다. 후두암 세포주인 SNUH-46은 ACL-4배지를 이용하어 수립되있으나 수립된 후는 R10배지에서 더 빨리 성장하는 것을 알 수 있있다. R10배지에서는 수립 초기 단계에 섬유세포의 과증식으로 세포주를 수립할 수 없었으나 ACL-4에서는 섬유세포의 성장이 거의 관찰되지 않았다.
1988년에 21예의 종양 조직으로부터 AR5배지를 이용하여 직장암 세포주인 SNU-61과 대장암 세포주인 SNU-67을 수립할 수 있었으며 R10배지를 이용해서는 위선암 세포주인 SNU-55 및 SNU-64와 직장암 세포주인 SNU-70을 수립할 수 있있다.
SNU-61 직장암 세포주는 직장암 수술후 간에 전이가 발생하여 간절제후 전이 조직으로 부터 수립된 세포주로서 R10보다는 AR5에서 빠른 성장을 하였으며 일부 섬유아세포의 오염을 제거하기 위하여 ACL-4에서 수 주간 배양을 하였다.
SNU-67 대장암 세포주는 대장암 수술후 역시 간전이가 있어 간절제후 전이 조직으로 부터 수립되었는데 R10보다는 AR5에서 더 빨리 자랐으며 섬유아세포의 제거를 위하여 수 주간 ACL-4에서 유지시켰다. SNU-5, SNU-16, SNU-55 및 SNU-64등 위암 세포주들은 모두 R10을 이용하여 수립이 되었는데 ACL-4에서 성장이 잘 되지 않는 반면에 R10에서 잘 자라는 점으로 보아 ACL-4에 들어있지 않고 혈청에 있는 어떤 인자가 성장에 필요한 것으로 생각할 수 있다. SNU-5, SNU-16 및 SNU-1에 대하여는 이미 여러 가지 특성 분석이 완료되어 NCI-N87(미국 국립암 연구소에서 수립한 위암세포주) 위암 세포주와 함께 별도로 보고할 예정이다24).
특이한 점은 SNU-16 위암 세포주의 DNA에는 c-myc 유전자가 대단히 증폭(amplify)되어 있다는 점으로서, 현재까지의 위암 조직 및 누드 마우스에 계대되어온 위암 조직 몇 예에서 c-myc 유전자가 증폭된 것 이 보고되긴 하였으나 위암 세포주에서 c-myc 유전자가 중폭된 것이 발견된 것은 문헌상 찾아볼 수 없었다는 점이다24).
SNU-5(Fig. 1), SNUH-9 (Fig. 3), 및 SNUH-20 (Fig. 7) 세포주의 대부분 세포들은 부유하며 자라고 SNU-8(Fig. 2), SNUH-17(Fig. 5, 6), SNUH-46(Fig. 8, 9), SNU-47(Fig. 10), SNU-55(Fig. 11), SNU-61(Fig. 12), SNU-64(Fig. 13), SNU-67(Fig. 14,15) 및 SNU-70{Fig. 16) 세포주의 세포들은 배양 플라스크바닥에 부착하여 자라는 성질을 갖고 있으며 SNU-16 (Fig. 4) 세포주는 바닥에 붙거나 부유하며 자라고 있다.
ACL-4에서 배양이 된 세포주들은 모두 R10에서 배양이 가능하였으나 SNUH-17세포주는 R10에 배양할 수 있도록 적응시키는데 수 주 동안이 소요되었다. ACL-4배지 속의 어느 인자가 이 세포주의 성장에 중요한 지를 실험해본 결과 sodium pyruvate가 매우 중요하다는 사실과 함께 기본 배지에 sodium pyruvate, transferrin 및 인슐린을 첨가할 경우 SNUH-17 및 Hela 세포주의 성장이 ACL-4에서와 큰 차이가 없음이 발견되었으며1) RPMI 1640에 이 세가지 인자가 첨가된 배지 (R-TIP으로 부르기로 함)에서 SNUH-17 및 Hela 세포주가 장기간 계속 잘 자라는 것이 증명되었다.
세포주의 성장 속도를 세포의 수가 2배로 늘어나는 시간으로 표시할 때 SNU-5는 R10배지에서 34시간, SNUH-9은 ACL-4배지에서 39시간, SNU-16은 R10 배지에서 27시간, SNUH-17 세포주는 ACL-4배지에서 40시간이고 R10배지에서 64시간이었며, SNUH-20은 ACL-4배지에서 40시간이었고 SNU-47은 R10 배지에서 82시간이었다. SNU-1, SNU-5 및 SNU-16 위암 세포주는 flow cytometry를 이용한 immunophenotyping상 어느것도 B세포 혹은 T세포 표지인자와 반응을 보이지 않았으므로 EBV-transformed B세포나 혹은 다른 림프계 세포로 오염되어 있지 않음을 알 수 있었다. 림프아구양 세포주인 SUNH-9와 SNUH-20 세포주는 큰 세포 덩어리(clumps)를 형성하며 부유되어 자라고 세포 형태 관찰을 위해 cytocentrifuge(Shandon 사)를 이용하여 유리슬라이드에 세포원침 도말표본을 만들어 Wright 염색을 한 결과는 Fig. 3,7과 같다. 두 세포주 모두에서 각 세포주 구성 세포의 형태와 크기는 매우 다양하였으나 두 세포주 간에 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. 핵은 대개 원형 내지 난원형이고 때로 함몰된 부위가 있었고 흔히 크고 뚜렷한 핵소체를 가지고 있었다. 세포질의 양은 중등도 내지 풍부한 편이었으며 연한 푸른색 내지 진한 푸른색을 띠었고 때로 세포질내 공포가 관찰되었다. 이러한 형태는 일반적으로 림프아구양 세포주에서 볼 수 있는 형태에 합당한 소견이었다.
SNUH-9과 SNUH-20 두 세포주 모두 세포표지검사에서 I2(HLA-DR), B4(B cell specific antigen) 및 Smlg에 양성반응을 나타내 Smlg 양성인 B 림프구 계열의 세포주(B lymphoblastoid cell line)인 것으로 확인되었다(Table 3).
고 안
비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 규정 배지인 ACL-4는 비소세포 폐암 이외에 대장암세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한 것으로 보고되었다11, 20).
세포 배양시에 호르몬, 영양소, 결합 단백질 및 부착 인자등의 보충을 위해 RPMI-1640과 같은 기본 배지에 첨가 하여주는 우태혈청을 넣지 않고 세포를 배양하고자 할 때에는 일반적으로 그 세포의 성장에 필요한 인자들을 따로 첨가해 주어야 한다. 폐 선암 세포주 및 대장암 세포주들을 서서히 적응 시키면 아무런 성장 인자의 보충 없이도 기본 배지에서 키울 수 있음이 보고되었으나6) 새로운 세포주의 수립에는 반드시 성장 인자들의 첨가가 필수적이다.
ACL-4에 함유된 인자들에는 ① 대부분 세포들의 성장에 필요한 것으로 알려진 인슐린(20 ug/ml) ② 철-결합 혈청 단백질이며 때로는 배지내의 미량의 독성 금속원소들을 제거하는 해독 단백질로도 알려져 있고 거의 모든 세포의 성장에 필요한 transferrin(10 ug/ml)3) ③ 필수 영양소이며 glutathione peroxidase속에 효소 구성 성분 및 활성제로서 존재하고 무혈청 배지내에서 세포주의 장기간 성장에 필요한 것으로 알려 진 셀레늄25, 27, 28, 31)이 sodium selenite(25nM)로서 들어 있고 ④ 무혈청 배지내에서 Hela(인체 자궁암), MDCK(개의 신장), ZR-75-1인체 유방암), RF-1(쥐 난소), HC84S(인체 대장암) 및 L6(쥐 myoblast) 세포주의 성장에 도움을 준 것으로 알려진 hydrocortisone2) (50 nM), ⑤ 무혈청 배지내에서 Hela, MCF-7(인체 유방암), TM4(생쥐 고환), HC84S, HLE222(사람폐 상피양 암) 및 BHK(hamster 신장 섬유아세포) 세포주의 성장에 필요한 epidermal growth factor2) (1 ng/ml), ⑥ 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세포막 phospholipid의 주요 구성 요소의 하나인 phosphatidyl ethanolamine을 합성 하는데 기질로 사용되며 무혈청 배지에서 유방 상피 세포, 쥐의 hybridoma와 사람의 epidermal keratinocyte를 자라게 하는 데 필요한 ethanolamine과 phosphoryl ethanolamine(각각 10uM)15), ⑦ 무혈청 배지에서 GH3(쥐의 뇌하수체 암), MDCK, ZR-75-1, HC84S 및 HLE222 세포주의 성장을 잘하게 하는 T3 (triiodothyronine, 100 pM)2) ⑧ 림프구 세포막의 구조적 integrity를 유지하는데 필요하다고 알려진 알부민은 여기에 결합된 지방산이 배양시 세포막의 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 하며 또 알부민 자체가 미량의 성장 인자와 호르몬을 수반할 수 있으며 또 배지내 미량의 억제인자들을 결합하여 그들의 활동을 차단하는 역할을 하고14, 18, 26, 30), 배지 1 ml에 5 mg의 알부민을 첨가하면 10%혈청이 첨가된 배지에서 발견되는 농도와 같은데 ACL-4에는 1 ml의 배지에 2 mg의 우혈청 알부민이 첨가되었고 ⑨ 액체 배지에서 불안정한 글루타민을 2mM첨가하고 ⑩ 세포 배양시 세포수가 적을 때 에너지 원으로 유용한 sodium pyruvate12, 17)가 RPMI-1640 배지에는 들어 있지 않으므로 0.5 mM농도로 첨가되어있고 ⑪ 완충 기능을 갖는 혈청이 없는 것을 보충하기 위해 Hepes buffer가 10 mM첨가되어 있다.
SNUH-9은 급성골수성백혈병 환자의 흉수에서, SUNH-20은 위암 환자의 복수에서 수립된 B-림프아구양 세포주이다.
B 림프구 계열의 세포주(B-lymphoid cell lines)는 세포주의 기원(origin) 에 따라 크게 두가지로 구분된다. 즉 백혈병, 악성림프종 등의 악성 종양에서 기원된 것과 비종양성의 정상 림프구에서 기원된 림프아구양 세포주의 두가지이다.
림프아구양 세포주 (B-lymphoblastoid cell lines)는 혈청학적으로 Epstein-Barr virus (EBV) 양성인 정상인 또는 악성 종양환자의 혈액, 골수, 림프조직 등으로 부터 매우 높은 빈도로 쉽게 세포주를 만들 수가 있다. 이 경우에 B 림프아구양 세포주는 대개 악성종양 세포가 아닌, EBV를 함유하고 있는 정상세포군(clone)으로 부터 기원하며 다음과 같은 몇가지 특징이 있다16). 형태학적으로 큰 세포 덩어리(clumps)를 형성하며 자라고 림프아구의 형태를 취하며 한 세포주 내의 구성 세포간에는 크기와 형태의 변화가 심하나 B 림프아구양 세포주의 서로 다른 세포주 간에는 형태학적 차이가 없다. 세포의 분화 단계는 intermediate B cell 단계에 속하며 세포질면역글로부린(CIg)과 세포표면면역글로부린(Smlg)을 표현하고, 분비하는 면역글로부린은 악성종양 유래 B-림프구 계열 세포주와 달리 polyclonal한 것이 특징이다.
본 연구에서 수립한 SNUH-9과 SNUH-20세포주는 상기한 형태학적 특징을 가지고 있으며 세포표지 검사상 I2(HLA-DR), B4(Bcell특이항원) 및 Smlg양성의 결과를 보여 B림프구에서 기원한 세포주임이 확인되었다.
무혈청 규정배지인 ACL-4는 이미 알려진대로 섬유세포의 성장을 억제하면서 대장암 및 직장암 세포의 성장을 가능케 하였다. 본 실험에서는 자궁경부암과 후두암 세포주의 수립에 ACL-4가 유용하게 사용될 수 있음을 알아내었다. 흥미롭게도 ACL-4 배지는 B-림프아구양 세포의 성장을 잘하게 하였는데 ACL-4는 많은 폐 종양표본에서 B 림프아구양 세포들의 성장에도 효과가 있으며(H.K, Oie와 의견 교환) 인체 myeloma 세포주의 수립에도 성공적으로 사용되었음이 보고되었다9).
본 실험의 초기단계에 나타났듯이 ACL-4 배지가 모든 종양세포의 배양에 유용한 것은 아니었으므로 앞으로는 초기에는 혈청이 첨가된 배지인 AR5 배지를 사용하여 암세포의 성장을 유도하고 그후 섬유세포를 제거하기 위하여 감별 트립신 처리나 무혈청 배지의 사용을 하는 것이 좋을 것으로 사료된다.
아직 까지 세포주로서 확립 되진 않았으나 계속 살아서 서서히 성장하는 조직들에 대하여는 세포주가 수립되면 추후 다른 기회 에 보고할 예정이다.
앞으로 본 논문에 보고된 세포주들에 대한 여러가지 특성 분석이 이루어 짐과 아울러 이 세포주들이 여러 관련분야 연구원들에 의하여 널리 활용되기를 기대한다.
결 론
여러 종류의 암 세포주 수립을 위한 ACL-4의 유용성을 알아보기 위하여 여러가지 종양 조직을 R10, ACL-4 및 AR5 배지내에서 배양하여 비교하였다. 11 종류의 암세포주가 수립되었는데 R10에서 7가지의 세포주 (위암 4, 직장암 1, 난소암 1, 골육종 1), ACL-4에서 2종류의 세포주 (자궁암 1, 후두암 1), AR5 배지에서 2종류 (대장암 1, 직장암 1)의 세포주를 수립할 수 있었다.
흥미로운 것은 위암환자와 급성골수성 백혈병 환자로부터 2종류의 비종양성 B 림프아구양 세포주가 수립된 점이다.
본 연구의 전반기에 섬유아세포의 성장이 무혈청배지인 ACL-4에서 효과적으로 억제되는 것을 발견하였으므로 후반기에는 섬유아세포의 과증식으로 암 세포의 배양이 소실될 우려가 있을 때는 혈청을 함유한 배지를 ACL-4로 바꾸어 섬유아세포를 제거하도록 노력하였다.
69예의 종양으로부터 현재까지 단 11종류의 새로운 세포주를 수립하였지만 본 연구에서는 혈청함유 여부에 무관하게 ACL-4 배지가 자궁암 및 후두암 세포를 배양하는데 사용될 수 있음을 알게되었다.
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