『SNU-80 ~ SNU-280 : 1988년 8월 ~ 1989년 10월 』, 박재갑 외 40인, 성장인자 및 성장 호르몬 첨가 배지를 이용한 SNU 세포주 수립에 관한 연구, 대한암학회지, 1990;22:1-13.
Journal of Korean Cancer
Association 22, 1, March, 1990
= Abstract =
Establishment of SNU Cell Lines in Growth Factor and Growth Hormone Supplemented Medium
•본 논문은 1989년도 서울대학교 의과대학 기초의학 전홍연구비，서울대학교병원 정책연구비 및 한국과학재단의 목적기초 연구비의 보조에 의한 연구들로 이루어진 것임.
From August 1988 to October 1989, 212 specimens (Table 1) from a wide variety of human tumors were cultured in DF10 (DulbeccoTs modified MEM and Ham’s F12 plus 10% FBS) or ADF5 (ACL-4 medium made with DMEM and F12 plus 5% FBS). ADF5E (ADF5 plus estradiol) was used for ovarian cancer, endometrial cancer, uterine cervical cancer and breast cancer.
Twenty-two cancer cell lines (Table 2) were established … five cell lines (1 uterine leiomyosarcoma, 1 gastric leiomyosarcoma, 1 endometrial cancer, 1 glioblastoma multiforme of brain, 1 gastric cancer) in DF10; fourteen cell lines (1 thyroid cancer, 2 colon cancer, 2 rectal cancer, 2 retinoblastoma, 1 lung cancer, 1 multiple myeloma, 1 melanoma, 1 pancreas cancer, 2 hypernephroma, 1 laryngeal cancer) in ADF5; and three ovarian cancer cell lines in ADF5E. Three B lymphoblastoid (non-neoplastic) cell lines were established from a rectal cancer, lymphoma and AML specimen grown in ADF5.
Overall success rate will be reported later because several other lines are still growing, but two retinoblastoma cell lines from 4 specimens and 2 hypernephroma cell lines from 2 specimens were established in ADF5 medium and 3 ovarian cancer cell lines from 5 specimens were established in
ADE5E medium.
Although we were able to establish only twenty-two cancer cell lines from 212 specimens until now, our study extended the use of ADF5 medium for the growth of retinoblastoma and hypernephroma, and also use of ADF5E for the growth of ovarian cancer.
서 론
암 세포주는 현재 암 연구 분야에시 활발히 연구되고 있는 분야인 암 세포의 분화, 암 유전자 및 항암 유전자의 발현, 항암제 및 방사선 치료에 대한 감수성, 항암제에 대한 내성 및 내성환원제에 대한 실험, 암세포의 침습 및 전이와 전이를 방지할 수 있는 약물의 실험, 암 표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 역가측정 및 항암효과, 암 세포 성장 및 억제 인자와 세포 유전자 연구 등에 있이서 매우 유용하게 활용되고 있어6, 7, 13, 19~24), 저자들은 암 조직의 근원이 확실하면서 수립된 후 특성이 잘 분석될 수 있는 다양한 종류의 암 세포주를 수립하여 암 관련 연구분야의 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 1982년부터 노력하여 왔으며 이미 대장암 세포주인 SNU-C1, SNU-C2A, SNUC2B, SNU-C4 및 SNU-C5를 수립하여 보고하였으며20), 그 후 대장암 세포주 SNU-61, SNU 67 및 SNU-70, 위암 세포주 SNU-1, SNU-5 및 SNU-16, 난소암 세포주 SNU-8, 자궁 경부암 세포주 SNUH-17, 후두암 세포주 SNUH-46 및 골육종 세포주 SNU-47을 수립하여 보고하였다1). 1987년 12월 29일부터는 서울의대 암연구소 종양세포학 연구부내에 SNU 세포주 은행을 설립운영 하면서 국내외 연구기관들의 요청에 의하여 SNU 세포주들을 분양하여 주고 있다.
암 세포주의 개발에 있어 기본 영양소인 염분, 당분, 아미노산 및 비타민 이외에도 세포의 번식에는 잘 규정되지 않은 생물학적 용액 및 추출물 등이 필요하다고 알려져 왔다. 이를 위해서는 가장 쉽게 구할 수 있고 보관이 편한 혈청이 이용되어 왔다. 혈청 함유 배양액에는 어떤 암 세포의 배양에 필수적인 한 가지 또는 그 이상의 인자들이 결핍되어 있을 수 있다. 여러 사람들의 연구결과 세포들의 번식에 중요한 호르몬이나 기타 인자들이 밝혀져 왔고 또 가장 적절한 농도도 규명되었다2). 또 특수한 종양 세포의 배양을 위해 규정된 배지도 개발되어 왔는데 이러한 규정 배지들은 일반적으로 섬유세포의 발육보다는 암세포들의 발육을 더 잘하게 하여 세포주 수립의 성공율을 높일 수 있는 것으로 보고되어 있다2~5, 7, 8, 11, 15, 18, 20, 29).
규정 배지인 ACL(adenocarcinoma of lung)-4 배지는 비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 것이나4, 5, 8) 대장암 세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한것으로 보고되었으며8, 11, 20) 자궁암 및 후두암 세포를 배양하는데에도 사용될 수 있음이 보고되었다1).
저자들은 각종 종양조직으로부터 새로운 세포주를 수립하기 위하여 1982년부터 1985년까지는 R10배지(RPMI-1640 배지에 56°C에서 30분간 가열하여 비활성
화 시킨 우태혈청 10%를 첨가한 배지)를 사용하였으며 1987년도에는 R10배지와 함께 규정배지인 ACL-4배지를 동시에 사용하였고 1988년도에는 잠시동안 R10배지와 함께 AR5(RPMI-1640 배지를 기본배지로 하여 만든 ACL-4배지에 비활성화시킨 우태혈청 5%첨가)를 사용하였다.
본 실험에서는 기본배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 DF배지가 좀더 이상적일 것이라는 가정하에 R10대신에 DF10과 AR5 대신에 ADF5배지를 사용하고 여성암의 배양에는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하였다.
저자들은 암세포 배양시 계속 일련번호를 부여하고 그 조직의 배양이 성공하여 세포주가 수립되면 그 번호를 SNU- 뒤에 붙여 세포주 이름으로 부르고 있는데 1988년 11월에 SNU-70까지의 세포주를 보고하였으며1) 그 후 현재까지 SNU-350까지 번호가 부여되었다. 계속 새로운 세포주 수립을 위한 노력이 진행중이고 아직도 세포주의 수립단계에 있는 예들이 많아 더 장기간의 실험기간이 지난후에는 여러종류의 세포주를 더 보고할 수있을 것으로 사료되나 이미 수립된 세포주의 중요성과 아울러 이 세포주들을 다른 연구원들에게 분양하여 줄 때 기초 참고문헌이 요청되므로 저자들은 1988년 8월부터 1989년 10월까지 시도한 212예의 종양 조직으로부터 현재까지 세포주 수립이 완료된 22종류의 암세포주에 관하여 일차보고를 하고자 한다.
실 험 방 법
체외 배양에서 사용한 사람 종양 조직은 모두 서울대학교병원에 입원한 종양환자들의 수술중에 채취한 조직이거나 진단 혹은 항암제 투여 목적으로 입원중인 환자들의 혈액, 흉수 및 복수 등에서 얻었다.
고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용하였고 흉수나 복수 등은 원심 침전시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다. 백혈병 환자의 혈액은 Ficoll-Hypaque gradient를 이용하여 백혈구를 분리배양하였다.
25 cm2 플라스크에 약 1—5X106개의 세포가 들어가도록 분주하였다. DF10배지와 ADF5배지를 동시에 사용하였으며 여성암에서는 ADF5E(ADF5+17-β-estradiol 10 pM) 배지를 사용하였다. 종양 세포가 너무 많이 자라면 계대 배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존시켰다. 부유하여 자라는 세포들은 그대로 모아 일부를 계대시켰으며 플라스크 바닥에 붙어 가라앉는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기단계에서 간질 세포들의 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별 트립신 처리를 하였다.
DMEM과 Hams’ F12배지 및 혈청은 GIBCO (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, U.S.A.)로부터 구입하였다，5%의 탄산가스와 95% 공기가
공급되고 적절한 습기와 37°C가 유지되는 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다.
림프아구양 세포주(lymphoblastoid cell line)에 대해서는 T 및 B 림프구와 과립구 계열 세포에 대한 각종 세포표지를 검사하였다. 각종 세포표지의 특성은 Table 3과 같다. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)는 Bethesda kit (Bethesda Research Laboratories)을 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면면역 글로브린 (Smlg)은 FITC-conjugated anti-human immunoglobulins (IgG+IgA+IgM) (Cappel 사)을 이용하여 직접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면항원은 7종의 단세포군항체 (T1, T11, I2, B4, J5, MY9, MY7)를 이용하여 간접면역 형광법으로 검사하였다.
결 과
1988년 8월부터 1989년 10월까지 15개월간 212예의 종양조직 (Table 1)으로부터 DF10 과 ADF5 및 ADF5E배지를 이용하여 세포주 수립을 시도하여 22종
류(Table 2)의 암세포주와 3종류의 B-림프아구양 세포주가 수립되었다.
DF10 배지에서는 자궁 평활근육종 세포주(SNU-135, Fig. 6)，위 평활근육종 세포주(SNU441，Fig. 7)，子宮 內膜癌 세포주 (SMU-184,Fig. 11), 뇌 多形性勝芽細胞 腫세포주 (SNU-201，Fig. 12) 및 위선암 세포주(SNU-216, Fig. 16)가 각각 1종류씩 수립되었다.
ADF5 배지에서는 갑상선암 세포주 (SNU-80，Fig. 1), 細氣管肺胞細胞癌 세포주(SNU-160,Fig.9), 多發性 骨髓騰 세포주 (SNU-204，Fig. 13), 흑색종 세포주 (SNU.207, Fig. 14), 췌장암 세포주(SNU-213, Fig. 15) 및 후두암 세포주 (SNU-266, Fig. 20)가 각각 1종류씩 수립되었고 결장암 세포주(SNU-81, Fig.2; SNU-175, Fig. 10), 직장암 세포주 (SNU-254, Fig. 19; SNU-280, Fig. 22), 網膜芽細胞癌 세포주(SNU-125, Fig. 4; SNU-126, Fig. 5) 및 신장암 세포주(SNU-228, Fig. 17; SNU-267，Fig.21)들이 각각 2종류씩 수립되었다.
ADF5E 배지에서는 난소암 세포주가 3종류 (SNU-119, Fig. 3; SNU-145, Fig. 8; SNU-251, Fig. 18) 수립되었다. 그리고 ADF5배지내에서 직장암 조직 및 림프종 환자의 흉수와 급성골수성 백혈병 환자의 혈액으로부터 각각 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265 B-림프아구양 세포주가 수립되었다.
아직도 배양되고 있는 여러 조직들이 세포주로 수립될 가능성이 많으므로 동 기간 동안에 배양을 시도한 전체 종양의 종류에 따른 성공율은 추후 발표할 예정이다. 그러나 망막아세포종의 경우는 4례를 배양시도하여 ADF5 배지에서 2예의 세포주를 수립할 수 있었고 신장암의 경우는 2예를 배양시도하여 ADF5배지에서 모두 세포주로 수립 할 수 있었으며 난소암의 경우는 ADF5E배지에서 5예를 배양시도하여 3예의 세포주를 수립할 수 있었다.
B-림프아구양 세포주들과 다발성 골수종 세포주 및 망막아세포종 세포주들은 모두 부유하여 자라고 나머지 세포들은 모두 배양 플라스크의 바닥에 부착하여 자라는 성질을 갖고 있다.
B-림프아구양 세포주인 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265는 모두 세포 표지검사에서 12 (HLA-DR), B4 (B세포 특이 항원) 및 Smlg에 양성반응을 나타내어 Smlg 양성인 B 림프구 계열의 세포주로 생각되나 SNU-99세포주는 MY7(+)인 점이 보통과 다르다 (Table 3).
SNU-204 다발성 골수종 세포주는 세포원침 도말 표본을 만들어 Wright염색하여 관찰한 결과 세포의 크기가 다양하고 핵이 여러개거나 多葉性으로 되어 있으며 핵소체가 현저하였다. 일부 세포는 핵주위의 유두륜이있는 전형적인 形質細胞의 형태를 갖고 있다.
세포주의 수립을 위하여 과거에는 기본배지에 우태혈청이 10%전후 함유된 배지를 사용하였으며 이러한 방법으로 저자들은 1982년부터 1984년까지 30예의 위암 조직중 1예 (3.3%)에서 위암 세포주 SNU-1을 수립할 수 있었다. 암 세포주 수립의 성공율을 높이기 위하여 최근 에는 여러종류의 무혈청 규정 배지가 개발되고 있는데 폐선암세포의 배양을 위해 개발된 무혈청 규정 배지인 ACL-4는 대장 및 직장암세포의 배양에도 사용할 수 있다는 것이 박등에 의하여 발표되었고24) 또 최근 자궁경부암 및 후두암 세포주 수립에도 사용할 수 있다는 것이 박등에 의하여 보고되었다1). 그러나 무혈청 규정배지인 ACL-4배지를 이용하여 각종 종양 세포의 배양을 시도한 결과 ACL-4배지만으로는 세포주 수립의 성공율이 매우 낮았고 ACL-4배지와 함께 비교를 위한 대조배지로 사용한 R10 배지에서 수령된 세포주를 포함하여도 저자들은 69예의 종양조직중 겨우 11예 (16%)에서 암 세포주를 수립할 수 있었고1) 동결보존후 다시 회복이 안되는 SNU-55 및 SNU-64세포주를 제외하면 겨우 9예 (13%)의 세포주가 수립되었을 뿐이다.
본 연구에서는 암 세포주 수립의 성공을을 높이기 위하 여 ACL-4 제조를 위한 기본 배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 DF배지가 좋으리라고 생각하여 DF 배지를 이용한 ACL-4배지 즉 ADF배지를 만들었다. 그리고 ADF배지에 없는 인자중 아직도 잘 모르나 성장에 필요한 다른 인자들의 보충을 위하여 이러한 규정배지에 우태혈청을 5%첨가한 ADF5배지를 이용하여 섬유아세포를 포함한 각종 세포의 성장을 유도하고 일단 암 세포가 함께 배양이 되면 섬유아세포를 제거하기 위하여 감별 트립신 처리를 하였다.
그리고 난소암, 유방암 및 자궁암 세포등의 배양을 위하여는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하였다.
ACL-4에 함유된 인자들에는 ① 대부분 세포들의 성장에 필요한 것으로 알려진 인슐린(20 ug/ml) ② 철-결합 혈청 단백질이며 때로는 배지내의 미량의 독성 금속원소들을 제거하는 해독 단백질로도 알려져 있고 거의 모든 세포의 성장에 필요한 transferrin(10 ug/ml)3) ③ 필수 영양소이며 glutathione peroxidase속에 효소 구성 성분 및 활성제로서 존재하고 무혈청 배지내에서 세포주의 장기간 성장에 필요한 것으로 알려 진 셀레늄25, 27, 28, 31)이 sodium selenite(25nM)로서 들어 있고 ④ 무혈청 배지내에서 Hela(인체 자궁암), MDCK(개의 신장), ZR-75-1(인체 유방암), RF-1(쥐 난소), HC84S(인체 대장암) 및 L6(쥐 myoblast) 세포주의 성장에 도움을 준 것으로 알려진 hydrocortisone2) (50 nM), ⑤ 무혈청 배지내에서 Hela, MCF-7(인체 유방암), TM4(생쥐 고환), HC84S, HLE222(사람폐 상피양 암) 및 BHK(hamster 신장 섬유아세포) 세포주의 성장에 필요한 epidermal growth factor2) (1 ng/ml), ⑥ 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세포막 phospholipid의 주요 구성 요소의 하나인 phosphatidyl ethanolamine을 합성 하는데 기질로 사용되며 무혈청 배지에서 유방 상피 세포, 쥐의 hybridoma와 사람의 epidermal keratinocyte를 자라게 하는 데 필요한 ethanolamine과 phosphoryl ethanolamine(각각 10uM)15), ⑦ 무혈청 배지에서 GH3(쥐의 뇌하수체 암), MDCK, ZR-75-1, HC84S 및 HLE222 세포주의 성장을 잘하게 하는 T3 (triiodothyronine, 100 pM)2) ⑧ 림프구 세포막의 구조적 integrity를 유지하는데 필요하다고 알려진 알부민은 여기에 결합된 지방산이 배양시 세포막의 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 하며 또 알부민 자체가 미량의 성장 인자와 호르몬을 수반할 수 있으며 또 배지내 미량의 억제인자들올 결합하여 그들의 활동올 차단하는 역할올 하고14, 18, 26, 30), 배지 1 ml에 5 mg의 알부민을 첨가하면 10%혈청이 첨가된 배지에서 발견되는 농도와 같은데 ACL-4에는 1 ml의 배지에 2 mg의 우혈청 알부민이 첨가되었고 ⑨ 액체 배지에서 불안정한 글루타민을 2mM첨가하고 ⑩ 세포 배양시 세포수가 적을 때 에너지 원으로 유용한 sodium pyruvate12, 17)가 RPMI-1640 배지에는 들어 있지 않으므로 RPMI-1640을 기본배지로 사용시 0.5 mM농도로 첨가되어있고 ⑪ 완충 기능을 갖는 혈청이 없는 것을 보충하기 위해 Hepes buffer가 10 mM첨가되어 있다.
1989년 8월 18일 세포주 수립에 사용하고 있던 CO2 배양기의 온도가 밤사이 48°C 까지 을라가는 사고가 발생하여 그 사고 이전에 세포주 수립이 완결되어 동결시켜 두었던 9종류를 제외하고 배양중이던 세포들을 모두 잃어버렸고, 일차 암 조직세포를 동결시켜 두었던 경우에서만 사고후에 다시 배양을 시도할 수 있었으며 또 아직도 여러 종류의 종양 세포가 자라고 있으므로 본 논문에서 세포주 수립의 전체적인 성공율을 말할 수는 없겠으나 배양을 시도한 212 예의 종양 중 현재까지 겨우 22예 (10%)의 세포주를 수립할 수 있었다. 저자들의 경험과 비교하여 보면 기본배지로서의 DF 배지는 일차로 모든 세포들을 잘 자라게 해주는 장점은 있는듯하나 동시에 섬유아세포의 성장도 강력하여 세포주 수립에 좋은 배지는 아닌 것으로 사료된다.
그러나 ACL-4 배지에 근거한 ADF5배지를 이용하여 망막아세포종의 경우는 배양 시도한 4예중 2예에서, 신장암의 경우는 배양시도한 2예 모두에서 세포주를 수립할 수 있었으며 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지에서는 5예의 난소암중 3예에서 세포주 수립이 가능하였으므로 이들 세종류 암의 세포주 수립에는 이러한 배지들이 유용할 것으로 사료된다.
본 연구기간 중에 수립된 SNU-80 갑상선 암 세포주, SNU-125 및 SNU-126 망막아세포종 세포주들과, SNU-204 다발성 골수종 세포주 등은 세계적으로 보고가 흔치 않은 세포주들로 앞으로 연구에 많이 활용될 것으로 기대된다.
B림프구 계열의 세포주는 세포주의 기원에 따라 크게 두가지로 구분된다. 즉 백혈병, 악성림프종 등의 악성종양에서 기원된 것과 비종양성의 정상 림프구에서 기원된 림프아구양 세포주의 두가지이다.
B-림프아구양 세포주는 혈청학적으로 앱스타인 바르 바이러스 양성인 정상인 또는 악성 종양환자의 혈액, 골수, 림프조직 등으로 부터 매우 높은 빈도로 쉽게 세포주를 만들 수가 있다. 이 경우에 B림프아구양 세포주는 대개 악성종양 세포가 아닌, 앱스타인 바르 바이러스를 함유하고 있는 정상세포군으로부터 기원하며 다음과 같은 몇가지 특징이 있다16). 형태학적으로 큰 세포 덩어리를 형성하며 자라고 림프아구의 형태를 취하며 한 세포주내의 구성 세포간에는 크기와 형 태의 변화가 심하나 B-림프아구양 세포주의 서로 다른 세포주 간에는 형태학적 차이가 없다. 세포의 분화 단계는 중간 B세포단계에 속하며 세포질 면역글로부린 (Cig)과 세포표면 면역글로부린 (Smlg)을 표현하고, 분비하는 면역글로부린은 악성종양 유래 B-림프구 계열 세포주와 달리 polyclonal한 것이 특징이다.
본 연구에서 수립한 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265 세포주들은 상기한 형태학적 특징을 가지고 있으며 세포표지 검사상 I2 (HLA-DR), B4 (B cell특이항원) 및 Smlg 양성의 결과를 보여 B림프구에서 기원한 세포주임이 확인되었다. 그러나 SNU-99 세포주는 MY7(+)인 점이 보통과 다르다. ADF5배지는 B-림프아구양 세포의 성장을 잘하게 하였는데 ACL-4배지가 많은 폐 종양표본에서 B 림프아구양 세포들의 성장에도 효과가 있으며 인체골수종 세포주의 수립에도 성공적으로 사용되었음이 보고되었고 저자들도 이미 이를 확인한 바 있다1).
아직까지 세포주로서 확립되진 않았으나 계속 살아서 서서히 성장하는 조직들에 대하여는 세포주가 수립되면 추후 다른 기회에 보고할 예정이다.
앞으로 본 논문에 보고된 세포주들에 대한 여러가지 특성 분석이 이루어짐과 아울러 이 세포주들이 여러 관련분야 연구원들에 의하여 널리 활용되기를 기대한다.
본 연구 기간중 갑상선암 세포주, 망막아세포종 세포주 및 다발성 골수종 세포주 등의 희귀한 세포주들을 수립할 수 있었다. 망막아세포종 세포주 및 신장암 세포주의 수립에는 ADF5배지를 사용할 수 있고 난소암 세포주 수립에는 ADF5E배지를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
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Association 22, 1, March, 1990
성장인자 및 성장 호르몬 첨가 배지를 이용한 SNU 세포주 수립에 관한 연구
서울대학교 의과대학 암 연구소 종양 세포학 연구실, SNU 세포주 은행 및 외과1, 내과2, 소아과3
산부인과4, 정형외과5, 신경외과6, 흉부외과7, 비뇨기과8, 이비인후과9, 안과10
임상병리과11, 병리과12, 미국 국립암연구소 및 해군병원13
박재갑1 • 권남숙1 • 노동영1 • 홍인규1 • 오승근1 • 이건욱1 • 박용현1 • 홍성국1 • 최국진1
김진복1 • 김수태1 • 허대석2 • 방영주2 • 박선양2 • 김노경2 • 고창순2 • 안효섭3
최영민4 • 강순범4 • 신희철4 • 이효표4 • 김승욱4 • 이상훈5 • 이한구5 • 왕규창6
정희원6 • 김현집6 • 한대희6 • 성숙환7 • 김주현7 • 이상은8 • 이종욱8 • 김시황8
김영균8 • 김광현9 • 유영석10 • 박명희11 • 박성회12 • 김용일12
허버트 오이13• 아디 가즈다13
= Abstract =
Establishment of SNU Cell Lines in Growth Factor and Growth Hormone Supplemented Medium
Jae-Gahb Park1, M.D., Nam-Sook Kwon1, Dong Young Noh1, M.D., Inn Gyu Hong1, M.D.,
Seoung-Keun Oh1, M.D., Kuhn Uk Lee1, M.D., Yong Hyun Park1, M.D., Song Cook Hong1, M.D.,
Kuk Jin Choe1, M.D., Jin-Pok Kim1, M.D., Soo Tae Kim1, M.D., Dae Seog Heo2, M.D.,
Yung Jue Bang2, M.D., Seon Yang Park2, M.D., Noe Kyeong Kim2, M.D., Chang Soon Koh2, M.D.,
Hyo Seop Ahn3, M.D., Young Min Choi4, M.D., Soon Beom Kang4, M.D., Hee Chul Shin4, M.D.,
Hyo Pyo Lee4, M.D., Syng Wook Kim4, M.D., Sang Hoon Lee5, M.D., Han Koo Lee5, M.D.,
Kyu Chang Wang6, M.D., Hee Won Jung6, M.D., Hyun Jip Kim6, M.D., Dae Hee Han6, M.D.,
Sook Whan Sung7, M.D., Joo Hyun Kim7, M.D., Sang Eun Lee8, M.D., Chong Wook Lee8, M.D.,
Si Whang Kim8, M.D., Young Kyoon Kim8, M.D., Kwang Hyun Kim9, M.D., Young Suk Yu10, M.D.,
Myoung Hee Park11, M.D., Seong Hoe Park12, M.D., Yong II Kim12, M.D.,
Oie K. Herbert13, Ph. D. and Adi F. Gazdar13, M.D.
SNU Cell Line Bank, Laboratory of Tumor Cell Biology, Cancer Research Institute, and
Department of Surgery1, Internal Medicine2, Pediatrics3. Ob & Gyn4, Orthopedic Surgery5, Neurosurgery6,
Thoracic Surgery7, Urology8, Otolaryngology9, Ophthalmology10, Clinical Pathology11, and Pathology12,
College of Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul, 110-744, Korea,
and NCI-Navy Medical Oncology Branch13, National Cancer Institute and Naval Hospital,
Bethesda, Maryland, 20814, U.S.A.
Department of Surgery1, Internal Medicine2, Pediatrics3. Ob & Gyn4, Orthopedic Surgery5, Neurosurgery6,
Thoracic Surgery7, Urology8, Otolaryngology9, Ophthalmology10, Clinical Pathology11, and Pathology12,
College of Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul, 110-744, Korea,
and NCI-Navy Medical Oncology Branch13, National Cancer Institute and Naval Hospital,
Bethesda, Maryland, 20814, U.S.A.
From August 1988 to October 1989, 212 specimens (Table 1) from a wide variety of human tumors were cultured in DF10 (DulbeccoTs modified MEM and Ham’s F12 plus 10% FBS) or ADF5 (ACL-4 medium made with DMEM and F12 plus 5% FBS). ADF5E (ADF5 plus estradiol) was used for ovarian cancer, endometrial cancer, uterine cervical cancer and breast cancer.
Twenty-two cancer cell lines (Table 2) were established … five cell lines (1 uterine leiomyosarcoma, 1 gastric leiomyosarcoma, 1 endometrial cancer, 1 glioblastoma multiforme of brain, 1 gastric cancer) in DF10; fourteen cell lines (1 thyroid cancer, 2 colon cancer, 2 rectal cancer, 2 retinoblastoma, 1 lung cancer, 1 multiple myeloma, 1 melanoma, 1 pancreas cancer, 2 hypernephroma, 1 laryngeal cancer) in ADF5; and three ovarian cancer cell lines in ADF5E. Three B lymphoblastoid (non-neoplastic) cell lines were established from a rectal cancer, lymphoma and AML specimen grown in ADF5.
Overall success rate will be reported later because several other lines are still growing, but two retinoblastoma cell lines from 4 specimens and 2 hypernephroma cell lines from 2 specimens were established in ADF5 medium and 3 ovarian cancer cell lines from 5 specimens were established in
ADE5E medium.
Although we were able to establish only twenty-two cancer cell lines from 212 specimens until now, our study extended the use of ADF5 medium for the growth of retinoblastoma and hypernephroma, and also use of ADF5E for the growth of ovarian cancer.
서 론
암 세포주는 현재 암 연구 분야에시 활발히 연구되고 있는 분야인 암 세포의 분화, 암 유전자 및 항암 유전자의 발현, 항암제 및 방사선 치료에 대한 감수성, 항암제에 대한 내성 및 내성환원제에 대한 실험, 암세포의 침습 및 전이와 전이를 방지할 수 있는 약물의 실험, 암 표지 항원의 발현 및 분비, 단세포군 항체의 개발, 생체 반응 조절물질의 역가측정 및 항암효과, 암 세포 성장 및 억제 인자와 세포 유전자 연구 등에 있이서 매우 유용하게 활용되고 있어6, 7, 13, 19~24), 저자들은 암 조직의 근원이 확실하면서 수립된 후 특성이 잘 분석될 수 있는 다양한 종류의 암 세포주를 수립하여 암 관련 연구분야의 연구원들에게 분양하여 줄 목적으로 1982년부터 노력하여 왔으며 이미 대장암 세포주인 SNU-C1, SNU-C2A, SNUC2B, SNU-C4 및 SNU-C5를 수립하여 보고하였으며20), 그 후 대장암 세포주 SNU-61, SNU 67 및 SNU-70, 위암 세포주 SNU-1, SNU-5 및 SNU-16, 난소암 세포주 SNU-8, 자궁 경부암 세포주 SNUH-17, 후두암 세포주 SNUH-46 및 골육종 세포주 SNU-47을 수립하여 보고하였다1). 1987년 12월 29일부터는 서울의대 암연구소 종양세포학 연구부내에 SNU 세포주 은행을 설립운영 하면서 국내외 연구기관들의 요청에 의하여 SNU 세포주들을 분양하여 주고 있다.
암 세포주의 개발에 있어 기본 영양소인 염분, 당분, 아미노산 및 비타민 이외에도 세포의 번식에는 잘 규정되지 않은 생물학적 용액 및 추출물 등이 필요하다고 알려져 왔다. 이를 위해서는 가장 쉽게 구할 수 있고 보관이 편한 혈청이 이용되어 왔다. 혈청 함유 배양액에는 어떤 암 세포의 배양에 필수적인 한 가지 또는 그 이상의 인자들이 결핍되어 있을 수 있다. 여러 사람들의 연구결과 세포들의 번식에 중요한 호르몬이나 기타 인자들이 밝혀져 왔고 또 가장 적절한 농도도 규명되었다2). 또 특수한 종양 세포의 배양을 위해 규정된 배지도 개발되어 왔는데 이러한 규정 배지들은 일반적으로 섬유세포의 발육보다는 암세포들의 발육을 더 잘하게 하여 세포주 수립의 성공율을 높일 수 있는 것으로 보고되어 있다2~5, 7, 8, 11, 15, 18, 20, 29).
규정 배지인 ACL(adenocarcinoma of lung)-4 배지는 비소세포 폐암 세포주의 수립을 위하여 개발된 것이나4, 5, 8) 대장암 세포주의 수립 및 유지에도 매우 유용한것으로 보고되었으며8, 11, 20) 자궁암 및 후두암 세포를 배양하는데에도 사용될 수 있음이 보고되었다1).
저자들은 각종 종양조직으로부터 새로운 세포주를 수립하기 위하여 1982년부터 1985년까지는 R10배지(RPMI-1640 배지에 56°C에서 30분간 가열하여 비활성
화 시킨 우태혈청 10%를 첨가한 배지)를 사용하였으며 1987년도에는 R10배지와 함께 규정배지인 ACL-4배지를 동시에 사용하였고 1988년도에는 잠시동안 R10배지와 함께 AR5(RPMI-1640 배지를 기본배지로 하여 만든 ACL-4배지에 비활성화시킨 우태혈청 5%첨가)를 사용하였다.
본 실험에서는 기본배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 DF배지가 좀더 이상적일 것이라는 가정하에 R10대신에 DF10과 AR5 대신에 ADF5배지를 사용하고 여성암의 배양에는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하였다.
저자들은 암세포 배양시 계속 일련번호를 부여하고 그 조직의 배양이 성공하여 세포주가 수립되면 그 번호를 SNU- 뒤에 붙여 세포주 이름으로 부르고 있는데 1988년 11월에 SNU-70까지의 세포주를 보고하였으며1) 그 후 현재까지 SNU-350까지 번호가 부여되었다. 계속 새로운 세포주 수립을 위한 노력이 진행중이고 아직도 세포주의 수립단계에 있는 예들이 많아 더 장기간의 실험기간이 지난후에는 여러종류의 세포주를 더 보고할 수있을 것으로 사료되나 이미 수립된 세포주의 중요성과 아울러 이 세포주들을 다른 연구원들에게 분양하여 줄 때 기초 참고문헌이 요청되므로 저자들은 1988년 8월부터 1989년 10월까지 시도한 212예의 종양 조직으로부터 현재까지 세포주 수립이 완료된 22종류의 암세포주에 관하여 일차보고를 하고자 한다.
실 험 방 법
고형 종양 조직의 경우는 조직을 가위로 잘게 부수어 사용하였고 흉수나 복수 등은 원심 침전시킨후 배지에 부유시켜 사용하였다. 백혈병 환자의 혈액은 Ficoll-Hypaque gradient를 이용하여 백혈구를 분리배양하였다.
25 cm2 플라스크에 약 1—5X106개의 세포가 들어가도록 분주하였다. DF10배지와 ADF5배지를 동시에 사용하였으며 여성암에서는 ADF5E(ADF5+17-β-estradiol 10 pM) 배지를 사용하였다. 종양 세포가 너무 많이 자라면 계대 배양을 하면서 일부는 액체 질소 통에 동결 보존시켰다. 부유하여 자라는 세포들은 그대로 모아 일부를 계대시켰으며 플라스크 바닥에 붙어 가라앉는 세포들은 트립신 처리후 계대 배양을 하였다. 배양 초기단계에서 간질 세포들의 성장이 관찰되면 순수한 종양세포 집단들을 얻기 위하여 감별 트립신 처리를 하였다.
DMEM과 Hams’ F12배지 및 혈청은 GIBCO (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, U.S.A.)로부터 구입하였다，5%의 탄산가스와 95% 공기가
공급되고 적절한 습기와 37°C가 유지되는 배양기 속에서 배양을 하였다. 배양되는 세포의 모양은 위상차 현미경을 통하여 관찰하였다.
림프아구양 세포주(lymphoblastoid cell line)에 대해서는 T 및 B 림프구와 과립구 계열 세포에 대한 각종 세포표지를 검사하였다. 각종 세포표지의 특성은 Table 3과 같다. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)는 Bethesda kit (Bethesda Research Laboratories)을 이용하여 간접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면면역 글로브린 (Smlg)은 FITC-conjugated anti-human immunoglobulins (IgG+IgA+IgM) (Cappel 사)을 이용하여 직접면역형광법으로 검사하였다. 세포표면항원은 7종의 단세포군항체 (T1, T11, I2, B4, J5, MY9, MY7)를 이용하여 간접면역 형광법으로 검사하였다.
결 과
1988년 8월부터 1989년 10월까지 15개월간 212예의 종양조직 (Table 1)으로부터 DF10 과 ADF5 및 ADF5E배지를 이용하여 세포주 수립을 시도하여 22종
류(Table 2)의 암세포주와 3종류의 B-림프아구양 세포주가 수립되었다.
DF10 배지에서는 자궁 평활근육종 세포주(SNU-135, Fig. 6)，위 평활근육종 세포주(SNU441，Fig. 7)，子宮 內膜癌 세포주 (SMU-184,Fig. 11), 뇌 多形性勝芽細胞 腫세포주 (SNU-201，Fig. 12) 및 위선암 세포주(SNU-216, Fig. 16)가 각각 1종류씩 수립되었다.
ADF5 배지에서는 갑상선암 세포주 (SNU-80，Fig. 1), 細氣管肺胞細胞癌 세포주(SNU-160,Fig.9), 多發性 骨髓騰 세포주 (SNU-204，Fig. 13), 흑색종 세포주 (SNU.207, Fig. 14), 췌장암 세포주(SNU-213, Fig. 15) 및 후두암 세포주 (SNU-266, Fig. 20)가 각각 1종류씩 수립되었고 결장암 세포주(SNU-81, Fig.2; SNU-175, Fig. 10), 직장암 세포주 (SNU-254, Fig. 19; SNU-280, Fig. 22), 網膜芽細胞癌 세포주(SNU-125, Fig. 4; SNU-126, Fig. 5) 및 신장암 세포주(SNU-228, Fig. 17; SNU-267，Fig.21)들이 각각 2종류씩 수립되었다.
ADF5E 배지에서는 난소암 세포주가 3종류 (SNU-119, Fig. 3; SNU-145, Fig. 8; SNU-251, Fig. 18) 수립되었다. 그리고 ADF5배지내에서 직장암 조직 및 림프종 환자의 흉수와 급성골수성 백혈병 환자의 혈액으로부터 각각 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265 B-림프아구양 세포주가 수립되었다.
아직도 배양되고 있는 여러 조직들이 세포주로 수립될 가능성이 많으므로 동 기간 동안에 배양을 시도한 전체 종양의 종류에 따른 성공율은 추후 발표할 예정이다. 그러나 망막아세포종의 경우는 4례를 배양시도하여 ADF5 배지에서 2예의 세포주를 수립할 수 있었고 신장암의 경우는 2예를 배양시도하여 ADF5배지에서 모두 세포주로 수립 할 수 있었으며 난소암의 경우는 ADF5E배지에서 5예를 배양시도하여 3예의 세포주를 수립할 수 있었다.
B-림프아구양 세포주들과 다발성 골수종 세포주 및 망막아세포종 세포주들은 모두 부유하여 자라고 나머지 세포들은 모두 배양 플라스크의 바닥에 부착하여 자라는 성질을 갖고 있다.
B-림프아구양 세포주인 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265는 모두 세포 표지검사에서 12 (HLA-DR), B4 (B세포 특이 항원) 및 Smlg에 양성반응을 나타내어 Smlg 양성인 B 림프구 계열의 세포주로 생각되나 SNU-99세포주는 MY7(+)인 점이 보통과 다르다 (Table 3).
SNU-204 다발성 골수종 세포주는 세포원침 도말 표본을 만들어 Wright염색하여 관찰한 결과 세포의 크기가 다양하고 핵이 여러개거나 多葉性으로 되어 있으며 핵소체가 현저하였다. 일부 세포는 핵주위의 유두륜이있는 전형적인 形質細胞의 형태를 갖고 있다.
고 안
세포주의 수립을 위하여 과거에는 기본배지에 우태혈청이 10%전후 함유된 배지를 사용하였으며 이러한 방법으로 저자들은 1982년부터 1984년까지 30예의 위암 조직중 1예 (3.3%)에서 위암 세포주 SNU-1을 수립할 수 있었다. 암 세포주 수립의 성공율을 높이기 위하여 최근 에는 여러종류의 무혈청 규정 배지가 개발되고 있는데 폐선암세포의 배양을 위해 개발된 무혈청 규정 배지인 ACL-4는 대장 및 직장암세포의 배양에도 사용할 수 있다는 것이 박등에 의하여 발표되었고24) 또 최근 자궁경부암 및 후두암 세포주 수립에도 사용할 수 있다는 것이 박등에 의하여 보고되었다1). 그러나 무혈청 규정배지인 ACL-4배지를 이용하여 각종 종양 세포의 배양을 시도한 결과 ACL-4배지만으로는 세포주 수립의 성공율이 매우 낮았고 ACL-4배지와 함께 비교를 위한 대조배지로 사용한 R10 배지에서 수령된 세포주를 포함하여도 저자들은 69예의 종양조직중 겨우 11예 (16%)에서 암 세포주를 수립할 수 있었고1) 동결보존후 다시 회복이 안되는 SNU-55 및 SNU-64세포주를 제외하면 겨우 9예 (13%)의 세포주가 수립되었을 뿐이다.
본 연구에서는 암 세포주 수립의 성공을을 높이기 위하 여 ACL-4 제조를 위한 기본 배지로 RPMI-1640 대신에 각 영양소의 함량이 높은 DMEM과 영양소의 종류가 다양하게 함유된 Ham’s F12를 1:1로 혼합한 DF배지가 좋으리라고 생각하여 DF 배지를 이용한 ACL-4배지 즉 ADF배지를 만들었다. 그리고 ADF배지에 없는 인자중 아직도 잘 모르나 성장에 필요한 다른 인자들의 보충을 위하여 이러한 규정배지에 우태혈청을 5%첨가한 ADF5배지를 이용하여 섬유아세포를 포함한 각종 세포의 성장을 유도하고 일단 암 세포가 함께 배양이 되면 섬유아세포를 제거하기 위하여 감별 트립신 처리를 하였다.
그리고 난소암, 유방암 및 자궁암 세포등의 배양을 위하여는 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지를 사용하였다.
ACL-4에 함유된 인자들에는 ① 대부분 세포들의 성장에 필요한 것으로 알려진 인슐린(20 ug/ml) ② 철-결합 혈청 단백질이며 때로는 배지내의 미량의 독성 금속원소들을 제거하는 해독 단백질로도 알려져 있고 거의 모든 세포의 성장에 필요한 transferrin(10 ug/ml)3) ③ 필수 영양소이며 glutathione peroxidase속에 효소 구성 성분 및 활성제로서 존재하고 무혈청 배지내에서 세포주의 장기간 성장에 필요한 것으로 알려 진 셀레늄25, 27, 28, 31)이 sodium selenite(25nM)로서 들어 있고 ④ 무혈청 배지내에서 Hela(인체 자궁암), MDCK(개의 신장), ZR-75-1(인체 유방암), RF-1(쥐 난소), HC84S(인체 대장암) 및 L6(쥐 myoblast) 세포주의 성장에 도움을 준 것으로 알려진 hydrocortisone2) (50 nM), ⑤ 무혈청 배지내에서 Hela, MCF-7(인체 유방암), TM4(생쥐 고환), HC84S, HLE222(사람폐 상피양 암) 및 BHK(hamster 신장 섬유아세포) 세포주의 성장에 필요한 epidermal growth factor2) (1 ng/ml), ⑥ 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세포막 phospholipid의 주요 구성 요소의 하나인 phosphatidyl ethanolamine을 합성 하는데 기질로 사용되며 무혈청 배지에서 유방 상피 세포, 쥐의 hybridoma와 사람의 epidermal keratinocyte를 자라게 하는 데 필요한 ethanolamine과 phosphoryl ethanolamine(각각 10uM)15), ⑦ 무혈청 배지에서 GH3(쥐의 뇌하수체 암), MDCK, ZR-75-1, HC84S 및 HLE222 세포주의 성장을 잘하게 하는 T3 (triiodothyronine, 100 pM)2) ⑧ 림프구 세포막의 구조적 integrity를 유지하는데 필요하다고 알려진 알부민은 여기에 결합된 지방산이 배양시 세포막의 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 하며 또 알부민 자체가 미량의 성장 인자와 호르몬을 수반할 수 있으며 또 배지내 미량의 억제인자들올 결합하여 그들의 활동올 차단하는 역할올 하고14, 18, 26, 30), 배지 1 ml에 5 mg의 알부민을 첨가하면 10%혈청이 첨가된 배지에서 발견되는 농도와 같은데 ACL-4에는 1 ml의 배지에 2 mg의 우혈청 알부민이 첨가되었고 ⑨ 액체 배지에서 불안정한 글루타민을 2mM첨가하고 ⑩ 세포 배양시 세포수가 적을 때 에너지 원으로 유용한 sodium pyruvate12, 17)가 RPMI-1640 배지에는 들어 있지 않으므로 RPMI-1640을 기본배지로 사용시 0.5 mM농도로 첨가되어있고 ⑪ 완충 기능을 갖는 혈청이 없는 것을 보충하기 위해 Hepes buffer가 10 mM첨가되어 있다.
1989년 8월 18일 세포주 수립에 사용하고 있던 CO2 배양기의 온도가 밤사이 48°C 까지 을라가는 사고가 발생하여 그 사고 이전에 세포주 수립이 완결되어 동결시켜 두었던 9종류를 제외하고 배양중이던 세포들을 모두 잃어버렸고, 일차 암 조직세포를 동결시켜 두었던 경우에서만 사고후에 다시 배양을 시도할 수 있었으며 또 아직도 여러 종류의 종양 세포가 자라고 있으므로 본 논문에서 세포주 수립의 전체적인 성공율을 말할 수는 없겠으나 배양을 시도한 212 예의 종양 중 현재까지 겨우 22예 (10%)의 세포주를 수립할 수 있었다. 저자들의 경험과 비교하여 보면 기본배지로서의 DF 배지는 일차로 모든 세포들을 잘 자라게 해주는 장점은 있는듯하나 동시에 섬유아세포의 성장도 강력하여 세포주 수립에 좋은 배지는 아닌 것으로 사료된다.
그러나 ACL-4 배지에 근거한 ADF5배지를 이용하여 망막아세포종의 경우는 배양 시도한 4예중 2예에서, 신장암의 경우는 배양시도한 2예 모두에서 세포주를 수립할 수 있었으며 에스트로겐을 첨가한 ADF5E배지에서는 5예의 난소암중 3예에서 세포주 수립이 가능하였으므로 이들 세종류 암의 세포주 수립에는 이러한 배지들이 유용할 것으로 사료된다.
본 연구기간 중에 수립된 SNU-80 갑상선 암 세포주, SNU-125 및 SNU-126 망막아세포종 세포주들과, SNU-204 다발성 골수종 세포주 등은 세계적으로 보고가 흔치 않은 세포주들로 앞으로 연구에 많이 활용될 것으로 기대된다.
B림프구 계열의 세포주는 세포주의 기원에 따라 크게 두가지로 구분된다. 즉 백혈병, 악성림프종 등의 악성종양에서 기원된 것과 비종양성의 정상 림프구에서 기원된 림프아구양 세포주의 두가지이다.
B-림프아구양 세포주는 혈청학적으로 앱스타인 바르 바이러스 양성인 정상인 또는 악성 종양환자의 혈액, 골수, 림프조직 등으로 부터 매우 높은 빈도로 쉽게 세포주를 만들 수가 있다. 이 경우에 B림프아구양 세포주는 대개 악성종양 세포가 아닌, 앱스타인 바르 바이러스를 함유하고 있는 정상세포군으로부터 기원하며 다음과 같은 몇가지 특징이 있다16). 형태학적으로 큰 세포 덩어리를 형성하며 자라고 림프아구의 형태를 취하며 한 세포주내의 구성 세포간에는 크기와 형 태의 변화가 심하나 B-림프아구양 세포주의 서로 다른 세포주 간에는 형태학적 차이가 없다. 세포의 분화 단계는 중간 B세포단계에 속하며 세포질 면역글로부린 (Cig)과 세포표면 면역글로부린 (Smlg)을 표현하고, 분비하는 면역글로부린은 악성종양 유래 B-림프구 계열 세포주와 달리 polyclonal한 것이 특징이다.
본 연구에서 수립한 SNU-99, SNU-205 및 SNU-265 세포주들은 상기한 형태학적 특징을 가지고 있으며 세포표지 검사상 I2 (HLA-DR), B4 (B cell특이항원) 및 Smlg 양성의 결과를 보여 B림프구에서 기원한 세포주임이 확인되었다. 그러나 SNU-99 세포주는 MY7(+)인 점이 보통과 다르다. ADF5배지는 B-림프아구양 세포의 성장을 잘하게 하였는데 ACL-4배지가 많은 폐 종양표본에서 B 림프아구양 세포들의 성장에도 효과가 있으며 인체골수종 세포주의 수립에도 성공적으로 사용되었음이 보고되었고 저자들도 이미 이를 확인한 바 있다1).
아직까지 세포주로서 확립되진 않았으나 계속 살아서 서서히 성장하는 조직들에 대하여는 세포주가 수립되면 추후 다른 기회에 보고할 예정이다.
앞으로 본 논문에 보고된 세포주들에 대한 여러가지 특성 분석이 이루어짐과 아울러 이 세포주들이 여러 관련분야 연구원들에 의하여 널리 활용되기를 기대한다.
결 론
1988년 8월부터 1989년 10월까지 212예의 각종 인체 종양조직으로부터 DF10, ADF5 혹은 ADF5E 배지를 이용하여 22예 (10%)의 암 세포주와 3종류의 B-림프아구양 세포주를 수립하였다.본 연구 기간중 갑상선암 세포주, 망막아세포종 세포주 및 다발성 골수종 세포주 등의 희귀한 세포주들을 수립할 수 있었다. 망막아세포종 세포주 및 신장암 세포주의 수립에는 ADF5배지를 사용할 수 있고 난소암 세포주 수립에는 ADF5E배지를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
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